СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА Российский патент 2007 года по МПК C07K1/22 C07K14/47 C07K14/82 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в фармацевтической промышленности и медицине для получения препарата альфа-фетопротеина (АФП), относящегося к группе иммуномодуляторов и используемого в качестве средства для лечения онкологических, аутоиммунных и аллергических заболеваний. Способ позволяет увеличить чистоту целевого продукта.

АФП представляет собой онкофетальный гликопротеин с молекулярной массой около 70 кД, продуцируемый клетками печени и брюшной стенки плода. Сырьем для получения АФП служит абортивная, пуповинная и плацентарная кровь, получаемая при медицинских абортах и родах от клинически здоровых женщин, прошедших стандартное обследование. Получаемый материал обязательно тестируется на отсутствие антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) и на отсутствие вируса гепатита В и антител к вирусу гепатита С.

Разработан способ получения АФП из эмбриональной ткани человека (А.с. №403407, кл³ А61К 35/48 "Способ получения биостимулятора"; Заявл. 26.11.68; Опубл. 26.10.73), включающий ее измельчение, помывку, обработку трипсином в течение 1 ч при температуре не более 37°С. Полученную суспензию клеток культивируют в питательной среде в течение 7-8 суток при 37°С, а целевой продукт отделяют центрифугированием при 3000 об/мин. Получают прозрачную жидкость оранжево-желтого цвета, содержащую 10% АФП. Недостатками данного способа являются низкий выход и высокое содержание примесных белков.

Известен способ получения АФП из опухолевой ткани человека, включающий выделение и хроматографическую очистку целевого продукта последовательно на нескольких сорбентах (А.с. 2094077, А61К 38/00 «Хроматографический способ выделения альфа-фетопротеина». / Кулаев Д.В. и др. (Россия). - №96113901\25; Заявл. 23.06.97; Опубл. 27.10.97). Его недостатком является высокая трудоемкость процесса и низкий выход целевого продукта.

Существует способ получения АФП из эмбриональной ткани человека (А.с. 1497806 СССР, МКИ⁴ А61К 37/02. 48 "Способ получения альфа-фетопротеина"), включающий обработку исходного материала бутиловым спиртом, центрифугирование, диализ водно-белковой фазы относительно 0,9%-ного раствора натрия хлорида, центрифугирование, инкубирование полученного супернатанта с эстрогеном в конечной концентрации 0,005% при температуре 0-10°С в течение 8 ч и выделение целевого продукта из супернатанта хроматографией на сефарозе CL-4B с иммобилизованным эстрогеном. Выход целевого продукта составляет 60-70%, а чистота препарата 90-95%.

Недостатками способа являются низкая чистота целевого продукта, наличие примеси альбумина и гемоглобина, а также высокая трудоемкость способа и необходимость работы с легковоспламеняющимся резко пахнущим органическим реактивом - бутиловым спиртом.

Одним из наиболее близких к изобретению является способ получения АФП из эмбриональной ткани человека 8-12 нед, полученной при медицинских абортах, включающий стадии: измельчение и гомогенизация эмбриональной ткани; центрифугирование гомогената при 5000 об/мин; осветление супернатанта центрифугированием 12000 об/мин; очистка целевого продукта хроматографией на ДЕ-целлюлозе; очистка целевого продукта хроматографией на сефадексе G-100 с иммобилизованным на нем красителем цибакрон голубой F36-A; очистка целевого продукта рехроматографией на сефадексе G-100 с иммобилизованным на нем красителем цибакрон голубой F26-A; очистка целевого продукта хроматографией на ДЕ-целлюлозе (Huse Klaus et all. "A novel purification procedure for human fetoproteun by application of immobilized Cibacron Blu F36-A as affinity ligand Clinica Chimica Acta", 133, 1983,335-340).

Недостатками описанного способа являются длительность процедуры, низкий выход (25-30%) и недостаточная чистота (85-90%) целевого продукта, высокая трудоемкость и необходимость в сложном аппаратурном оснащении (высокоскоростные центрифуги).

В качестве прототипа выбран способ получения АФП (А.с. 2100031, А61К 31/715. «Способ получения препарата альфа-фетопротеина». / В.В.Стариков и др. (Россия). - №96111118/14; Заявл. 01.12.95; Опубл. 27.12.97; Бюл. №36). Абортивную кровь человека центрифугируют, полученный супернатант подвергают двустадийной хроматографической очистке (аффинная хроматография на Br-CN-сефарозе с иммобилизованными козьими антителами к АФП и аффинная хроматография на Br-CN-сефарозе с иммобилизованным сбалансированным комплексом козьих антител к белкам крови человека. Полученный раствор АФП обессоливают путем диализа против воды, стерилизуют и лиофилизируют.

Недостатками прототипа являются низкий выход (60-70%) и высокая контаминация примесными белками (декларированная чистота 90-95%) целевого продукта. Реально описанная технология не позволяет стабильно получать чистый целевой продукт в силу следующих обстоятельств. Вторая аффинная хроматография на Br-CN-сефарозе с иммобилизованным сбалансированным комплексом антител к белкам крови человека направлена на доочистку препарата от контаминации, представляющей собой исключительно белки крови человека (в частности IgG), которые могут попадать в препарат после первой хроматографической процедуры. Но в описанной технологии используется сорбент - Br-CN-сефароза с иммобилизованными козьими антителами к АФП. Следовательно, весьма вероятна контаминация препарата альфа-фетопротеина именно этими (козьими) антителами вследствие известного и, практически, неизбежного явления «подтекания лиганда». В этом случае применение описанного второго сорбента не оправдано и не эффективно. Следует вводить стадию освобождения от козьих иммуноглобулинов.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является увеличение чистоты выделяемого АФП без введения дополнительных стадий в технологию очистки. Поставленная задача достигается следующим образом.

Проверенную на отсутствие вируса гепатита В, антител к ВИЧ, гепатиту С абортивную, пуповинную или плацентарную кровь центрифугируют, добавляют в нее натрия хлорид (0,1-1,0 моль/л) и тритон Х-100 (0,01-0,5%) для блокирования неспецифической сорбции и инактивации вирусов, вновь центрифугируют и подвергают стерилизующей фильтрации через последовательный ряд фильтров с размером пор от 3,0 до 0,22 микрона. Подготовленную таким образом стерильную сыворотку наносят на сорбент с иммобилизованными антителами к АФП. Неспецифически сорбировавшиеся компоненты крови вымываются с сорбента последовательно 4-5 объемами 0,15 М фосфатно-солевого буферного раствора рН 7,0-7,5, содержащего 0,5 М хлорида натрия и таким же объемом раствора хлорида натрия (0,15 моль/л). Аффинно-связанный АФП элюируется глицин-HCl буферным раствором (0,05-0,15 моль/л).

Элюат нейтрализуется до рН 6,0-8,0, диализуется против фосфатно-солевого буферного раствора и наносится на сорбент с иммобилизованным Белком G, где происходит аффинная сорбция иммуноглобулинов (ИГ) (негативная иммуносорбция), контаминирующих препарат после первой аффинной очистки вне зависимости от их (ИГ) видоспецифичности. При этом осуществляется исчерпывающее извлечение из препарата примесей ИГ. Препарат, полученный после негативной иммуносорбции, готов для приготовления из него субстанции АФП. Подобный положительный эффект становится возможным благодаря тому, что белок G, выделенный из клеточной стенки стрептококка, обладает способностью чрезвычайно эффективно связываться с Fc-участками широкого спектра иммуноглобулинов G большинства млекопитающих.

Определяющим отличием предлагаемого способа от прототипа является гарантированная доочистка препарата до гомогенного состояния на втором иммуносорбенте, представляющем собой сефарозу, ковалентно модифицированную белком G.

Реализация заявляемого способа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1:

Все процедуры проводятся при +4°С. 3 л сыворотки крови центрифугируют со скоростью 3500 об/мин в течение 1 часа, осадок балластных веществ отбрасывают, а к 2,5 л супернатанта добавляют натрия хлорид до конечной концентрации 0,5 М и тритон Х-100 до конечной концентрации 0,01%. Центрифугирование повторяют и осуществляют стерилизующую фильтрацию через последовательно расположенные фильтры с размером пор: 3,0 мкм, 1,2 мкм, 0,45 мкм и 0,22 мкм. Стерильную кровь объединяют с 0,5 л сефарозы CL-4B с иммобилизованными антителами к АФП. Инкубацию осуществляют в течение 48 ч при постоянном перемешивании на орбитальном шейкере.

Неспецифически сорбировавшиеся компоненты крови вымывают с сорбента последовательно 4-5 объемами фосфатно-солевого буферного раствора, содержащего 0,5 М натрия хлорида и таким же количеством 0,15 М раствора натрия хлорида.

После отмывки сорбента раствором натрия хлорида (0,15 моль/л) проводят элюцию 0,1 М глицин-HCI буферным раствором с рН 2,5. Процесс элюции контролируют по оптической плотности при длине волны 280 нм. Элюция проводится до достижения базовых значений оптической плотности. Элюат, содержащий целевой продукт, нейтрализуют до рН 6,5-7,5, диализуют против фосфатно-солевого буферного раствора и наносят на колонку с сефарозой CL-4B с иммобилизованным Белком G. Скорость нанесения 60 мл/ч.

Полученный препарат, содержащий АФП, очищенный от глобулинов, альбумина и других примесных белков, концентрируют и диализуют относительно раствора натрия хлорида (0,15 моль/л).

Чистота полученого препарата анализируется методом электрофореза в градиенте плотности полиакриламидного геля. Чистота полученного препарата не менее 99%. Выход препарата составляет 85%. Полученный препарат тестируется на отсутствие антител к ВИЧ, вируса гепатита В и антител к вирусу гепатита С.

Пример 2:

Все процедуры проводятся при +4°С. 3 л сыворотки крови центрифугируют со скоростью 3500 об/мин в течение 1 часа, осадок балластных веществ отбрасывают, а к 2,5 л супернатанта добавляют натрия хлорид до конечной концентрации 0,5 М и тритон Х-100 до конечной концентрации 0,01%. Центрифугирование повторяют и осуществляют стерилизующую фильтрацию через последовательно расположенные фильтры с размером пор: 3,0 мкм, 1,2 мкм, 0,45 мкм и 0,22 мкм. Стерильную кровь наносят на хроматографическую колонку 5,0×40,0, заполненную 0,5 л сефарозы 4B-CL с иммобилизованными антителами к АФП, эквилибрированную фосфатно-солевым буферным раствором. Скорость нанесения 160 мл/ч. Нанесение осуществляется трехкратным прохождением наносимого объема через колонку в течение 48 ч.

Неспецифически сорбировавшиеся компоненты крови вымываются с сорбента последовательно фосфатно-солевым буферным раствором, содержащим 0,5 М натрия хлорида и 0,15 М раствором натрия хлорида, со скоростью 320 мл/ч до достижения базовых значений оптической плотности.

После отмывки сорбента раствором натрия хлорида (0,15 моль/л) проводят элюцию 0,1 М глицин-НС буферным раствором с рН 2,5 и скоростью 160 мл/ч. Процесс элюции контролируют по оптической плотности при длине волны 280 нм. Элюция проводится до достижения базовых значений оптической плотности. Элюат, содержащий целевой продукт, нейтрализуют до рН 6,5-7,5 диализуют против фосфатно-солевого буферного раствора и наносят на колонку с сефарозой CL-4B с иммобилизованным Белком G. Скорость нанесения 60 мл/ч.

Весь прошедший через колонку раствор, содержащий АФП, очищенный от глобулинов, альбумина и других примесных белков, концентрируют и диализуют относительно раствора натрия хлорида (0,15 моль/л).

Чистота полученного препарата анализируется методом электрофореза в градиенте плотности полиакриламидного геля. Чистота полученного препарата не менее 99%. Выход препарата составляет 85%. Полученный препарат тестируется на отсутствие антител к ВИЧ, вируса гепатита В и антител к вирусу гепатита С.

Таким образом показано, что использование предлагаемого способа позволяет гарантированно повысить чистоту целевого продукта, а следовательно, надежность технологии выделения и очистки за счет использования в качестве второго (доочищающего) сорбента сефарозу CL-4B с иммобилизованным на ней белком G.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения высокоочищенного белка альфа-фетопротеина. Для получения высокоочищенного белка альфа-фетопротеина из сыворотки крови человека на последней стадии окончательной доочистки используют аффинный сорбент, представляющий собой рекомбинантный белок G стрептококка, ковалентно конъюгированный с сефарозой. Способ позволяет увеличить чистоту выделяемого альфа-фетопротеина без введения дополнительных стадий в технологию очистки.

Способ выделения и очистки альфа-фетопротеина из сыворотки абортной, пуповинной или плацентарной крови человека с помощью двойной аффинной хроматографии, отличающийся тем, что для полного избавления от поливидовой иммуноглобулиновой контаминации в качестве второго аффинного сорбента используют сефарозу с Белком G.