СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ТРОФОБЛАСТИЧЕСКОГО БЕТА-1-ГЛИКОПРОТЕИНА Российский патент 2009 года по МПК A61K35/16 A61K38/17 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в медицине, биотехнологии для получения препарата трофобластического β-1-гликопротеина (ТБГ), используемого в качестве компонента диагностических систем и средства для лечения онкологических, аутоиммунных и аллергических заболеваний. Способ позволяет увеличить выход и чистоту целевого продукта.

Известно, что ТБГ, являясь специфическим маркером беременности, синтезируется клетками синцитиотрофобласта и выделяется в кровоток матери. По мнению большинства авторов ТБГ является гликопротеином, содержащим до 28% углеводов и имеющим молекулярную массу от 90000 Да (Bohn Н., 1974) до 113000 Да (Татаринов Ю.С. и др., 1974). Однако в литературе присутствуют данные о том, что ТБГ образует семейство, состоящее из 4 белков с молекулярной массой 72, 64, 62 и 54 кДа (Plouzek С.А., Chou J.Y., 1991). Другие же авторы полагают, что ТБГ является гетерогенным белком, гетерогенность которого обусловлена наличием двух вариантов ТБГ - альфа и бета (Pola A. et al., 1992). При этом молекулярный вес ТБГ-альфа равен 110 кД, а ТБГ-бета - 75 кД (Ito M. et al., 1981). Отсутствие достоверно подтвержденных данных о молекулярной гетерогенности ТБГ и точного описания структуры молекулы в значительной степени является причиной отсутствия эффективной системы его выделения и очистки. Источником для получения ТБГ является ретроплацентарная кровь.

Известен многоэтапный способ выделения ТБГ из ретроплацентарной крови человека [1]. Сыворотку, полученную из ретроплацентарной крови, фракционировали последовательно риванолом и сульфатом аммония, после чего подвергали гель-фильтрации на сефадексе G-25. Полученный материал подвергали ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. Фракции, содержащие ТБГ, объединяли, фракционировали сульфатом аммония и проводили гель-фильтрацию на сефадексе G-200. После очередного сульфатаммонийного фракционирования и диализа проводили хроматографию на колонке с гидросилапатитом и следом после осветления центрифугированием ионообменную хроматографию на микрогранулярной целлюлозе КМ-32. Завершающим этапом очистки являлось препаративное изоэлектрофокусирование на амфолинах с диапазоном 3,0-10,0. Результатом всей процедуры очистки являлось получение препарата ТБГ со степенью очистки 93%. Выход составлял 1,1%.

Процедура очистки, позволившая получить 1,8 мг относительно чистого искомого белка из пробы, содержащей 160 мг, предусматривает две процедуры гель-фильтрационной, две ионообменной, одну гидрофобной хроматографий, три процедуры сульфатаммонийного фракционирования и изоэлектрофокусирование.

Таким образом, явными недостатками описанного метода являются чрезвычайная громоздкость и трудоемкость, очень высокая затратность, особенно с учетом чрезвычайно низкого выхода целевого продукта, равного 1,1%.

Известен способ выделения ТБГ из отходов производства гаммаглобулина из ретроплацентарной крови [2], предусматривающий суспендирование твердого осадка, содержащего ТБГ в воде, центрифугирование и последующее сульфатаммонийное фракционирование. После 4-суточного диализа и центрифугирования полученный супернатант обрабатывают гидроксилапатитом и, проинкубировав 30-60 минут, вновь центрифугируют. Супернатант подвергают концентрированию на ультрафильтрах и двухсуточному диализу, после чего центрифугируют и лиофилизируют. Лиофилизированный препарат растворяют в фосфатном буфере и подвергают колоночной хроматографии на гидроксилапатите. Элюат диализуют в течение 36 часов и лиофилизируют. Выход составляет 35,5%, чистота препарата - 95%. Описанный способ превосходит предыдущий и по чистоте получаемого препарата, и по выходу, однако также весьма трудоемок, занимает существенное время и приводит к неоправданным потерям за счет многочисленных процедур диализа.

Теми же проблемами отягощены методы, предложенные И.И.Коптевой с соавт. [4] и Ю.А.Калинина с соавт. [5], которые при той же чистоте целевого продукта (95%) сопровождаются существенно меньшими выходами (20%).

Известен способ получения ТБГ из сыворотки ретроплацентарной крови или осадка, полученного при производстве гамма-глобулина из сыворотки ретроплацентарной крови [3], предусматривающий сульфатаммонийное фракционирование с последующим диализом в течение 4-х суток. После центрифугирования супернатант подвергают ионообменной хроматографии. Элюат концентрируют и диализуют в течение 72 часов. Отдиализованный препарат центрифугируют и пропускают через сорбент, содержащий лектин (конканавалин А). Элюированную фракцию, содержащую ТБГ, диализуют и лиофилизируют. Выход препарата при чистоте 96% составляет 20%.

В самой процедуре так называемого байч варианта описанной ионообменной хроматографии на гексилсефарозе заложены высокие количественные потери белка. Длительность осуществления способа, а также низкий выход целевого продукта не позволяют рассматривать описанный способ как решение проблемы выделения и очистки такого сложного белка как трофобластический бета-1-гликопротеин.

Ближайшим аналогом может быть рассмотрен способ, предложенный Ю.А.Калининой с соавт. [5]. Авторы использовали в качестве исходного материала ретроплацентарную кровь или осадок, полученный при производстве гамма-глобулина. С целью сокращения времени процедуры, авторы получали сульфатаммонийный осадок, который подвергали последовательно гель-фильтрационной хроматографии на сефадексе Г-100, ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе и хроматографии на сефарозе с иммобилизованным цибакрон-синим красителем. В завершение процесса, полученный продукт вновь подвергался гель-фильтрации на сефадексе Г-200. При этом авторы опрометчиво называют хроматографию на цибакрон-сефарозе аффинной, в то время как имеет место гидрофобная процедура. Многоэтапность процедуры выделения определяет ее трудоемкость и низкий выход целевого продукта (около 25%) при неплохих показателях чистоты (не менее 96%).

Технической задачей изобретения является увеличение выхода и чистоты выделяемого ТБГ. Поставленная задача достигается следующим образом.

Проверенную на отсутствие вируса гепатита В, антител к ВИЧ, гепатиту С ретроплацентарную кровь центрифугируют, добавляют в нее натрия хлорид (0,1-1,0 моль/л) и тритон Х-100 (0,01-0,1%) для блокирования неспецифической сорбции и инактивации вирусов, вновь центрифугируют. Подготовленную таким образом сыворотку насыщают сульфатом аммония до 30%, инкубируют в течение ночи при +4°С и перемешивании и центрифугируют. Осадок трижды отмывают 30% сульфатом аммония, суспендируют в 0,15 М фосфатно-солевом буферном растворе рН 7,0-7,5, содержащем 0,5 М хлорида натрия, и диализуют в ультрафильтрационной ячейке, пропуская 10-кратный объем буфера. Полученный препарат разводят в 5 раз 0,15 М фосфатно-солевым буферным раствором рН 7,0-7,5, содержащим 0,5 М хлорида натрия и 0,05% тритон Х-100, и подвергают ультрафильтрации в ультрафильтрационной ячейке с фильтром с пределом исключения 100000 Да. Полученный пермиат наносят на аффинный сорбент с иммобилизованными моноклональными антителами к ТБГ. Неспецифически сорбировавшиеся компоненты сыворотки вымывают с сорбента последовательно 4-5 объемами 0,15 М фосфатно-солевого буферного раствора рН 7,0-7,5, содержащего 0,5 М хлорида натрия, и таким же объемом 0,15 М раствора хлорида натрия. Аффинно-связанный ТБГ элюируют 0,1 М глицин-HCl буферным раствором.

Элюат быстро нейтрализуют до рН 6,5-7,5, диализуют против физраствора и лиофилизируют.

Определяющим преимуществом предлагаемого способа является возможность получения препарата ТБГ с высокой степенью чистоты и эффективным выходом целевого продукта.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Все процедуры проводят при +4°С. 200 мл ретроплацентарной крови центрифугируют со скоростью 10000 об/мин в течение 1 часа, осадок отбрасывают, а к супернатанту добавляют натрия хлорид до конечной концентрации 0,5 М и тритон Х-100 до конечной концентрации 0,05%. Центрифугирование повторяют. Сыворотку, содержащую 31 мг ТБГ, подготовленную таким образом, насыщают сульфатом аммония до 30% насыщения, инкубируют в течение ночи при перемешивании и центрифугируют со скоростью 10000 об/мин в течение 1 часа. Осадок трижды отмывают 30% сульфатом аммония, суспендируют в 0,15 М фосфатно-солевом буферном растворе рН 7,0-7,5, содержащем 0,5 М хлорида натрия и 0,05% тритон Х-100, диализуют в ультрафильтрационной ячейке, пропуская 10-кратный объем буфера. К полученному препарату добавляют 4 объема 0,15 М фосфатно-солевого буферного раствора рН 7,0-7,5, содержащего 0,5 М хлорида натрия и 0,05% тритон Х-100 и подвергают ультрафильтрации в ультрафильтрационной ячейке с использованием фильтра с пределом исключения 100000 Да до полного прохождения раствора через фильтр. Полученный пермеат объединяют с 40 мл сефарозы CL-6B, с «пришитыми» моноклональными антителами к ТБГ. Инкубацию осуществляют в течение 12 ч при постоянном перемешивании на орбитальном шейкере.

Неспецифически сорбировавшиеся компоненты сыворотки вымывают с сорбента последовательно 4-5 объемами фосфатно-солевого буферного раствора, содержащего 0,5 М натрия хлорида и таким же количеством 0,15 М раствора натрия хлорида. Сорбент помещают в хроматографическую колонку 2,5×8,5 см. После отмывки сорбента раствором натрия хлорида проводят элюцию 0,1 М глицин-НСl буферным раствором с рН 2,55 со скоростью 80 мл/ч, контролируя процесс по оптической плотности при длине волны 280 нм. Элюцию проводят до достижения нулевых значений оптической плотности. Фракцию, содержащую целевой продукт, немедленно нейтрализуют до рН 6,5-7,5, концентрируют, диализуют в ультрафильтрационной ячейке относительно физиологического раствора и лиофилизируют.

Чистота полученного препарата, анализируемая методом электрофореза в градиенте плотности полиакриламидного геля, составляет 98%. Выход препарата по данным иммуноферментного анализа составляет 23,3 мг (75%). Полученный препарат тестируют на отсутствие антител к ВИЧ, вируса гепатита В и антител к вирусу гепатита С.

Пример 2. Все процедуры проводят при +4°С. 200 мл ретроплацентарной крови центрифугируют со скоростью 10000 об/мин в течение 1 часа, осадок отбрасывают, а к супернатанту добавляют натрия хлорид до конечной концентрации 0,5 М и тритон Х-100 до конечной концентрации 0,05%. Центрифугирование повторяют. Сыворотку, содержащую 31 мг ТБГ, подготовленную таким образом, насыщают сульфатом аммония до 30% насыщения, инкубируют в течение ночи при перемешивании и центрифугируют со скоростью 10000 об/мин в течение 1 часа. Осадок трижды отмывают 30% сульфатом аммония, суспендируют в 0,15 М фосфатно-солевом буферном растворе рН 7,0-7,5, содержащем 0,5 М хлорида натрия и 0,05% тритон Х-100, диализуют в ультрафильтрационной ячейке, пропуская 10-кратный объем буфера. К полученному препарату добавляют 4 объема 0,15 М фосфатно-солевого буферного раствора рН 7,0-7,5, содержащего 0,5 М хлорида натрия и 0,05% тритон Х-100, и подвергают ультрафильтрации в ультрафильтрационной ячейке с использованием фильтра с пределом исключения 100000 Да до полного прохождения раствора через фильтр. Пермеат наносят на хроматографическую колонку 2,5×8,5, заполненную 40 мл сефарозы CL-6B, с «пришитыми» моноклональными антителами к ТБГ, эквилибрированную фосфатно-солевым буферным раствором. Скорость нанесения 40 мл/ч. Нанесение осуществляют трехкратным прохождением наносимого объема через колонку.

Неспецифически сорбировавшиеся компоненты крови вымывают с сорбента последовательно фосфатно-солевым буферным раствором, содержащим 0,5 М натрия хлорида, и 0,15 М раствором натрия хлорида со скоростью 80 мл/ч до достижения нулевых значений оптической плотности.

После отмывки сорбента проводят элюцию 0,1 М глицин-HCl буферным раствором с рН 2,55 и скоростью 40 мл/ч. Процесс элюции контролируют по оптической плотности при длине волны 280 нм. Элюция проводится до достижения нулевых значений оптической плотности. Фракцию, содержащую целевой продукт, немедленно нейтрализуют до рН 6,5-7,5, концентрируют, диализуют в ультрафильтрационной ячейке относительно физиологического раствора и лиофилизируют.

Чистота полученного препарата, анализируемая методом электрофореза в градиенте плотности полиакриламидного геля, составляет 98%. Выход препарата по данным иммуноферментного анализа составляет 25,1 мг (81%). Полученный препарат тестируют на отсутствие антител к ВИЧ, вируса гепатита В и антител к вирусу гепатита С.

Использование предлагаемого способа позволяет получать целевой продукт с высокой степенью чистоты (не менее 98%) и высоким: 75-81% выходом. Постадийная характеристика процедуры выделения и очистки приведена в таблице 1.

Таблица 1     Пример 1 Пример 2 № Операция Объем пробы (мл) Кол-во ТБГ (мг) Объем пробы (мл) Кол-во ТБГ (мг) 1 Сульфатаммонийное фракционирование 10 28 10 28 2 Ультрафильтрация 50 27 50 27 3 Аффинная хроматография 80 24,5 100 25,9 4 Концентрирование/диализ/центрифугирование 5,6 23,3 5,8 25,1 Выход 75% 81%

Источники информации

1. А.В.Соколов, Г.А.Козляев, Н.В.Меснянкин, Ю.С.Татаринов. Выделение и очистка специфичного β1-г-глобулина. «Вопросы медицинской химии», 1978, №24, с.240-244.

2. С.В.Мороз, С.К.Кривоносов, А.Ф.Павленко, Ю.С.Оводов, Ю.С.Татаринов. Способ получения трофобластического бета-1-гликопротеина из отходов ретроплацентарной крови при производстве гамма-глобулина. А.с. №1341736, приоритет 28.03.85.

3. С.К.Кривоносов, А.А.Терентьев, И.И.Коптева, И.В.Москвичева, П.П.Хохлов, А.К.Барсуков, Ю.С.Татаринов Способ получения трофобластического бета₁-гликопротеина. А.с. №1783644, приоритет 04.12.89.

4. И.И.Коптева, С.К.Кривоносов, Ю.С.Татаринов. Сравнительная физико-химическая характеристика препаратов трофобластического β₁-гликопротеина, выделенных из ретроплацентарной крови. Ж. «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины», 1990, №9, с.265-267.

5. Ю.А.Калинин, А.А.Терентьев, Ю.С.Татаринов. «Способ получения трофобластического бета₁-гликопротеина». А.с. №1836957, приоритет 25.03.90.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в медицине и биотехнологии. Способ выделения и очистки трофобластического бета-1-гликопротеина (ТБГ) из сыворотки ретроплацентарной крови выполняется путем фракционирования сульфатом аммония, отмывки и центрифугирования растворенного осадка, аффинной хроматографии на сефарозе с последующей элюцией целевого продукта и его лиофилизацией, при этом ретроплацентарную кровь центрифугируют при 10000 об/мин в течение часа, к супернатанту добавляют хлорид натрия до конечной концентрации 0,1-1,0 моль/л и тритон Х-100 до конечной концентрации 0,01-0,1%, центрифугирование повторяют, полученную сыворотку насыщают сульфатом аммония до 30%, инкубируют в течение ночи при перемешивании, центрифугируют, осадок трижды отмывают 30% сульфатом аммония, суспендируют в 0,15 М фосфатно-солевом буферном растворе рН 7,0-7,5, содержащем 0,5 М хлорид натрия и 0,05% тритон Х-100, диализуют в ультрафильтрационной ячейке, пропуская 10-ти кратный объем буферного раствора, затем разводят в 5 раз и проводят ультрафильтрацию с пределом исключения 100000 Да, полученный пермеат подвергают однократной аффинной хроматографии на сефарозе с иммобилизованными моноклональными антителами к ТБГ, элюируют аффинносвязанный ТБГ 0,1М глицин-HCl буферным раствором рН 2,55, элюат немедленно нейтрализуют, концентрируют, диализуют против физраствора и лиофилизируют. Изобретение обеспечивает повышение выхода и степени чистоты целевого продукта. 1 табл.

Способ выделения и очистки трофобластического бета-1-гликопротеина (ТБГ) из сыворотки ретроплацентарной крови путем фракционирования сульфатом аммония, отмывки и центрифугирования растворенного осадка, афинной хроматографии на сефарозе с последующей элюцией целевого продукта и его лиофилизацией, отличающийся тем, что ретроплацентарную кровь центрифугируют при 10000 об/мин в течение часа, к супернатанту добавляют хлорид натрия до конечной концентрации 0,1-1,0 моль/л и тритон Х-100 до конечной концентрации 0,01-0,1%, центрифугирование повторяют, полученную сыворотку насыщают сульфатом аммония до 30%, инкубируют в течение ночи при перемешивании, центрифугируют, осадок трижды отмывают 30%-ным сульфатом аммония, суспендируют в 0,15 М фосфатно-солевом буферном растворе рН 7,0-7,5, содержащем 0,5 М хлорид натрия и 0,05%-ный тритон Х-100, диализуют в ультрафильтрационной ячейке, пропуская 10-кратный объем буферного раствора, затем разводят в 5 раз и проводят ультрафильтрацию с пределом исключения 100000 Д, полученный пермеат подвергают однократной аффинной хроматографии на сефарозе с иммобилизованними моноклональными антителами к ТБГ, элюируют аффинносвязанный ТБГ 0,1М глицин-HCl буферным раствором рН 2,55, элюат немедленно нейтрализуют, концентрируют, диализуют против физраствора и лиофилизируют.