СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ТРОФОБЛАСТИЧЕСКОГО БЕТА-ГЛОБУЛИНА Российский патент 2005 года по МПК G01N33/493 

Изобретение относится к области медицины, а именно к биохимии, и может быть использовано для получения чистого препарата трофобластического β-глобулина (ТБГ).

В биохимической практике известен способ получения препарата ТБГ (Straube W., Kyank Н., Hofmann R., Klausch В. // Тезисы международного конгресса акушеров-гинекологов. М. - 1973. - С.245), включающий фракционирование белков биоматериала (сыворотка материнской, ретроплацентарной и пуповинной крови) сульфатом аммония, гель-проникающую хроматографию (ГПХ) на сефадексе G-200, ионообменную хроматографию и электрофокусирование.

Недостатками известного способа являются:

- многоэтапность, трудоемкость, сложность используемых методов;

- высокая стоимость реагентов, дороговизна и малодоступность исходного материала (сыворотка крови);

- инвазивный метод получения биоматериала;

- наличие в исходном материале большого количества балластных белков.

Известен также "Способ получения трофобластического β-гликопротеина из отходов ретроплацентарной крови при производстве гамма-глобулина" (Мороз С.В., Кривоносов С.К., Павленко А.С., Оводов Ю.С, Татаринов Ю.С.// авт. свидетельство №1341736 от 1 июня 1987 г.), состоящий в двухкратной обработке гидроксилапатитом осадка A₁-отходов при производстве гамма-глобулина.

Однако известный способ имеет следующие недостатки:

- обязательная привязка к производственному процессу и вследствие этого территориальная ограниченность получения исходного биоматериала;

- сложность, трудоемкость, длительность технологического процесса с учетом начальных этапов до образования осадка A₁;

- малодоступность применяемых сорбентов;

- наличие в исходном материале большого количества балластных белков.

Наиболее близким к предлагаемому является способ, предложенный Bohn H. - выделение и очистка ТБГ из плаценты путем поэтапного сочетания следующих методов: осаждение риванолом и сульфатом аммония, гель-фильтрация на сефадексах, препаративный зональный электрофорез на поливинилхлориде, ионообменная хроматография на ДЕАЕ-целлюлозе (Bohn H. - Isolierung und Charakterisierung des schwangerschaftspezifischen betal-glykoproteins//Blut. - 1972. - Bd.24. - S.292).

Недостатками прототипа являются:

- его техническая сложность, многоэтапность (длительность процесса очистки 6-7 суток), значительные трудозатраты;

- дороговизна и малодоступность сорбентов и реактивов, необходимых для практической реализации данного способа;

- необходимость большого количества исходного биоматериала за счет более низкой концентрации ТБГ в плаценте по сравнению с кровью.

Целью предлагаемого способа является повышение эффективности способа и упрощение его.

Поставленная цель в изобретении достигается тем, что в качестве исходного материала используют мочу беременных женщин поздних сроков, солевое фракционирование белков проводят сульфатом аммония 40% насыщения, раствор экспонируют в течение 8-10 ч, затем центрифугируют при 7000 об/мин в течение 20-25 минут, а осадок, разведенный 0,15 М раствором хлорида натрия, обессоливают диализом против 0,025 М фосфатного буфера с рН 7,4. В качестве исходного биоматериала используют мочу беременных женщин поздних сроков, больных гестозами.

Предлагаемый способ основан на том, что число белковых компонентов мочи беременных женщин поздних сроков значительно меньше таковых в сыворотке крови и других биологических жидкостях, в то время как концентрация ТБГ относительно высока. Кроме того, авторами показано, что в моче беременных женщин с гестозами средняя концентрация ТБГ достоверно выше таковой в моче здоровых беременных женщин аналогичных сроков. Это объясняется повышенной порозностью почечного барьера при гестозах.

Выявлены оптимальные параметры осаждающего реагента (40% от насыщающей концентрации сульфата аммония), обеспечивающие максимальный выход ТБГ практически без белковых примесей. В этих условиях альбумин и другие анодные белки, составляющие основную часть белков мочи беременных, остаются в надосадке. Величина экспозиции осаждения увеличена до 8-10 часов с целью более полного осаждения ТБГ из мочи. Разработаны оптимальные скорость (7000 об/мин) и время (20-25 мин) центрифугирования, обеспечивающие наиболее быструю и полную седиментацию ТБГ в минимальные сроки. 0,15 М раствор хлорида натрия выбран в качестве раствора разведения осадка ввиду доступности, изотоничности и хорошей сольватирующей способности. Для того чтобы полученный препарат в дальнейшем мог быть использован в работе с лабораторными животными, в качестве диализующего раствора выбран фосфатный буфер с физиологическим значением рН, ионным составом и отсутствием жестких анионов. Подобрана оптимальная ионная сила диализующего буферного раствора (0,025 моль/л), обеспечивающая максимальную скорость диализа при сохранении рН диализата.

Следовательно, применение мочи беременных женщин в качестве исходного биоматериала, выделение и очистка ТБГ по разработанной схеме значительно упрощает и повышает эффективность процесса. Способ сокращается до одного основного этапа очистки (осаждение) и одного вспомогательного (диализ).

Нами был разработан следующий алгоритм получения чистого препарата ТБГ:

- фракционирование сульфатом аммония 40% насыщения;

- диализ осадка против 0,025 М фосфатного буфера, рН 7,4.

На первом этапе проводили фракционирование белков мочи раствором сернокислого аммония 40% насыщения. Раствор экспонировали в течение 8-10 часов. Полученный осадок разводили 0,15 М раствором хлорида натрия и диализовали против 0,025 М фосфатного буфера, рН 7,4, в течение ночи (не менее 2 л буферного раствора на 1 мл растворенного осадка).

После каждого этапа предлагаемого способа проводили идентификацию ТБГ в полученных белковых фракциях методом иммунодиффузии в агаровом геле и контроль качества препарата методом иммуноэлектрофореза и электрофореза в ПААГ.

Применение данного способа позволяет получать ТБГ высокой степени чистоты при минимальных трудовых и финансовых затратах.

Предлагаемый способ был успешно апробирован в научной лаборатории кафедры биохимии Астраханской государственной медицинской академии в течение 2001-2002 гг.

Ниже приводятся результаты апробации:

Пример №1:

1-й этап: Осаждение сульфатом аммония.

Исходным материалом служила сливная моча беременных женщин поздних сроков (36-40 недель).

Использовали сухой, предварительно перекристаллизованный и хорошо измельченный порошок сернокислого аммония (ч.д.а.).

Сухой порошок сульфата аммония добавляли в мочу беременных женщин малыми порциями при постоянном помешивании в количестве, соответствующем 40% от насыщающей концентрации (242 г/л). Перемешивание продолжали в течение 20-30 минут после растворения последней порции соли. Осаждение проводили в течение 8 часов при комнатной температуре. Затем раствор центрифугировали при 7000 об/мин в течение 20 минут. Осадок, содержащий ТБГ, растворяли в физиологическом растворе до объема, превышающего объем осадка не более чем в 2 раза.

Полученные концентрированные белковые растворы хранились в холодильнике при -18°С.

2-й этап: диализ против 0.05 М фосфатного буфера рН 7.4.

Белковый концентрат, полученный на предыдущем этапе, содержал значительное количество сульфата аммония, который удаляли диализом против 0,025 М фосфатного буфера, рН 7,4 (не менее 2л буферного раствора на 1 мл растворенного осадка), в течение ночи при комнатной температуре.

Вывод: чистота полученного препарата ТБГ, определяемая методами иммуно диффузии с поливалентной антисывороткой на белки сыворотки крови беременных женщин и сравнительного электрофореза в полиакриламидном геле, оказалась высокой (см. чертеж, α - препарат ТБГ, выделенного из мочи; β - белковый спектр мочи беременных женщин поздних сроков).

Пример №2

Получение препарата ТБГ проводили по методике примера №1, но со следующими отличиями: осаждение проводили в течение 10 часов, раствор центрифугировали течение 25 минут.

Вывод: Средняя концентрация ТБГ в полученных фракциях составила 160±25 мг/л. Чистота полученного препарата ТБГ оказалась такой же высокой, как и в примере №1.

Пример №3:

Получение препарата ТБГ проводили по методике примера №1, но со следующими отличиями: осаждение проводили в течение 9 часов, раствор центрифугировали течение 22 минут.

Вывод: Средняя концентрация ТБГ в полученных фракциях составила 164±28 мг/л. Чистота полученного препарата ТБГ оказалась такой же высокой, как и в примерах №1 и №2.

Пример №4:

Получение препарата ТБГ проводили по методике примера №3, но с той разницей, что в качестве исходного биоматериала брали мочу беременных женщин, больных гестозами.

Вывод: Параметры и условия эксперимента в данном примере оказались оптимальными. Концентрация ТБГ в полученном препарате была еще выше, чем в примерах №1, №2 и №3 (245±16 мг/л), в то время как чистота полученного препарата ТБГ оказалась такой же высокой, как и в предыдущих примерах.

Пример №5

Получение препарата ТБГ проводили по методике примера №1, но со следующим отличием: фракционирование белков мочи на первом этапе осуществлялось раствором сульфата аммония 25% насыщения.

Вывод: ТБГ во фракциях отсутствовал в результате недостаточной концентрации осадителя для этого белка.

Пример №6

Получение препарата ТБГ проводили по методике примера №1, но со следующим отличием: фракционирование белков мочи на первом этапе осуществлялось раствором сульфата аммония 60% насыщения.

Вывод: Концентрация ТБГ в полученном белковом препарате была значительной, но не выше, чем в примерах № 1, №2 и №3. Однако чистота полученного препарата была неудовлетворительной. Объясняется это, очевидно, высокой высаливающей концентрацией сульфата аммония, в результате чего в осадке оказалась значительная часть балластных белков мочи.

Предлагаемый способ имеет следующие преимущества:

- технически прост, требует незначительных трудозатрат (для его применения достаточно 1 специалиста);

- значительное сокращение времени, необходимого для осуществления полного процесса очистки, - 2 дня (в прототипе 6-7 дней);

- дешевизна и доступность реактивов и вспомогательной аппаратуры, необходимых для практической реализации данного способа;

- использование неинвазивным методом полученного исходного биоматериала и его экономическое преимущество.

В дальнейшем полученный очищенный препарат ТБГ использовали, в частности, для получения моноспецифической антисыворотки на ТБГ путем иммунизации кроликов. Причем чистота полученного препарата ТБГ позволяла получить моновалентную антисыворотку на ТБГ, которая не требовала истощения. Полученная антисыворотка, в свою очередь, может быть использована для моделирования диагностической тест-системы на ТБГ.

Изобретение относится к области медицины. Способ характеризуется тем, что в качестве исходного материала используют мочу беременных женщин поздних сроков, либо мочу беременных поздних сроков, больных гестозами. Солевое фракционирование белков проводят сульфатом аммония 40% насыщения, раствор экспонируют в течение 8-10 ч, затем центрифугируют при 7000 об/мин в течение 20-25 минут, а осадок, разведенный 0,15 М раствором хлорида натрия, обессоливают диализом против 0,025 М фосфатного буфера с рН 7,4. Изобретение обеспечивает упрощение способа, сокращение времени процесса получения препарата. 1 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Способ получения препарата трофобластического β-глобулина, включающий фракционирование белков биоматериала осаждением и последующую их очистку диализом, отличающийся тем, что в качестве исходного материала используют мочу беременных женщин поздних сроков, солевое фракционирование белков проводят сульфатом аммония 40%-ного насыщения, раствор экспонируют в течение 8-10 ч, затем центрифугируют при 7000 об./мин в течение 20-25 мин, а осадок, разведенный 0,15 М раствором хлорида натрия, обессоливают диализом против 0,025 М фосфатного буфера с рН 7,4.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве исходного биоматериала используют мочу беременных женщин поздних сроков, больных гестозами.