Способ получения трофобластического бета @ -гликопротеина Советский патент 1993 года по МПК A61K37/04 

Изобретение относится к биологической химии, а именно к препаративной и биологической технологии и может быть использовано в технологии получения очищенногопрепарататрофобластспецифического бета-гликопро- теина (ТБГ), содержащегося в биологических жидкостях и тканях.

ТБГ является необходимым препаратом для иммунодиагностики беременности, ее патологий, а также для диагностики злокачественных новообразований, развивающихся из трофобласта (элементов хориона). В будущем возможно применение препарата ТБГ для получения антифертильных антисывороток и, в связи с обнаружением у этого белка иммунорегуляторных свойств, как им- муномодулягора при некоторых нарушениях иммунорегуляторной функции организма.

Если для диагностических целей не особенно важна высокая степень нативности данного белка, то для и мму но модул я торных

применений ТБГ должен выделяться в особо мягких условиях, В настоящее время в качестве сырья для получения ТБГ используется сыворотка крови беременных женщин, сыворотка ретроплацентарной крови, плацента, а также отходы сырья, используемого для производства гамма-глобулина-из ретроплацентарной крови, чаще всего осадок Аз.

Данный способ принят нами за прототип.

Целью изобретения является сокращение времени выделения (с 4-5 суток до 20 ч).

Отличительными признаками изобретения является то, что применяемая лоследо- вательность действий,состоящая из концентрирования (осаждение сульфатом аммония), гельфильтрации, при которой происходит определенное разведение материала при его очистке, концентрирование при ионообменной хроматографии и аффинной хроматографии, разведение при гель- фильтрации в системе летучего буфера с

СО CJ

Оч

чэ ел VI

оследующей лиофилизацией позволяет не рименять диализа, при котором особенно асходуется время из-за продолжительноти каждой пороцедуры диализа 1-2 суток, и озволяет получить целевой продукт пракически без примесей солей, так как при гельфильтрации происходит заодно и обес- соливание. Кроме того, используются широко известные и общепринятые в препаративной белковой химии реактивы: сефадексы и ДЕАЕ целлюлоза, а для аффин- . ной хроматографии используется иммоби- лизованный цибакрон синий краситель - аналог голубой сефарозы(способ получения которого защищен нами А.с. 968040 авт. Те- рентьев АА.и.др.}. можно также использовать и фирменную Голубую сефарозу (Швеция, Фармация файн Кемиклз). Отсутствие диализа в нашем способе получения способствует наибольшей сохранности на- тивности белка, так как известно, что в растворах с низкой ионной силой белки подвергаются микроденатурации, а ферменты быстро теряют свою энзимную актив- ность. Данная последовательность операций обеспечивает довольно хороший выход ТБГ (около 20%), причем чистота препарата составляет 95-96%.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами. :..

Пример 1. К 100мл сыворотки ретроп- лацентарной. крови,содержащей 8 мг ТБГ, добавляют сульфат аммония в количестве 30 г( насыщения) смесь инкубируют при перемешивании 1 час и далее центрифугируют 45 минут при 6000 об/мин, полученный осадок суспендируют в минимальном количестве воды, дистмллмоованной (получается 20 мл) и наносят на колонку е сефа- дексом Г-100 (колонка 5x100 см), выделяя при гельфильтрации окояо 90 мл фракции с максимальной концентрацией ТБГ(около 80 мг/л). Гелъфильтрацию проводили в 0,02 м аммоний-ацетатном буфере, Полученную фракцию, содержащую ТБГ подвергали ионообменной хроматографии на ДЕАЕ- целлюлрзе в том же буфере, осуществляя зяюцмю 0,2 М хлоридом натрия,-после отмывки от балластных белков 0,06 М хлоридом натрия. Получали около 20 мл элюата с концентрацией белка около 320 мг/л. Этот элюатбез всякой обработки подвергают аффинной хроматографии на сефарозе и иммобилизованным цибакроном синим. Отмывку проводят 0,2 М хлоридом натрия, а элюцию 2,0 М хлоридом натрия. Полученный элюат 5 мл с концентрацией ТБГ около 640 мг/л подвергают гельфильтрации на колонке с сефадексом Г-200 в 6,1 м аммоний-бикарбо- натном буфере рН 8.0, выделяя фракцию

5

0

белков с молекулярной массой 120000 даль- тон. При выделении узкого пика 22 мл с концентрациай ТБГ около 80 мг/л, получали препарат ТБГ чистотой около 95%. После лиофилизации было получено 2 мг белого белкового порошка ТБГ. Если учесть концентрацию белка 80 мг/л х 22 мл получено 1,76 мг ТБГ (выход целевого продукта около 22%), то есть в препарате присутствует не более 12% солей, оставшихся в результате не полного обессоливания при гельфильтрации. Это можно считать незначительными примесями, так как даже многосуточный диализ не может обеспечить полноту обессо- ливания.

П ример2.50 г осадка As. содержащего 32 мг ТБГ растворяют в 450 мл дистиллированной воды, центрифугируют при 6000 об/мин 30 минут, надосадочную жидкость отделяют и добавляют к ней сульфат аммония из расчета 300 г на 1 л (20% насыщения), тщательно перемешивают и через час центрифугируют при vex же условиях. Осадок растворяют в минимальном количестве дис- тилли рованной воды (получается около 21- 22 мл раствора или суспензии) и наносят на колонку с сефадексом Г-100, проводя гель- фильтрацию в тех же условиях, что и в примере 1. Получали 90 мл фракции с содержанием ТБГ около 320 мг/л. Эту фракцию подвергают ионообменной хроматографии в условиях аналогичных примеру 1. Получают около 20 мл элюата с концентрацией белкз - ТБГ около 1280 мг/л, который после очистки с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованном цибакрон синем красителе при условиях аналогичных примеру 1, дал фракцию в количестве 5 мл с содержанием ТБГ 2560 мг/л. В результате гельфильтрации этой фракции при тех же условиях, что и в примере 1, получали 20мл раствора с концентрацией ТБГ около 400 мг/л. После лиофилизации получали 8 мг препарата ТБГ, практически без солей. Чи- стота препарата .выше 96%. Выход около 25%.

5

0

5

0

П р и м е р 3. 50 г осадка As обрабатывают полностью аналогично примеру 2. Только аффинную хроматографию проводят на фирменной Голубой сефарозе, в результате чего получают 5 мл элюата с содержанием ТБГ около 2000 мг/л, из которого после гель- фильтрации протекавшей в тех же условиях, что в примерах 1 и 2, получено 22,5 мл препарата ТБГ с содержанием 320 мг/л. После лиофилизации получено 7,2 мг препарата ТБГ практически не содержащего солей. Следовательно выход ТБГ около 22,5%. Чи- стота препарата выше 96%.

Контроль за чистотой препарата осуществлялся иммунохимически и е помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Количественное определение ТБГ производили иммуннохимически.

Таким образом, предложенный способ получения ТБГ имеет определенные преимущества перед известным, что связано главным образом с сокращением времени на выделение препарата, отсутствием в про- цедуре выделения диализа против низкоионных растворов, что должно способствовать максимальному сохранению нативности препарата ТБГ, что может играть важную роль при выделении ТБГ с дальнейшим использованием его как биологически активного вещества. Кроме того, разработка различных значительно отличающихся между собой способов выделения ТБГ позволит при промышленном внедре- нии способов уменьшить зависимость производителя от наличия тех или иных реактивов.

Сочетание традиционных методов препаративной белковой химии (высаливание, гельфильтрация, ионообменная хроматография) с аффинной хроматографией на иммобилизованном цибакрон--синем красителе с заключительным этапом гель- фильтрации на сефадексе Г-200 в летучем буфере позволило добиться не только высокой чистоты препарата, но и относительно хорошего его выхода по целевому продукту (22-25%) в мягких условиях за одни сутки.

Формула изобретения Способ получения трофобластического бета1-гликопротеина путем обработки сыворотки ретроплацентарной крови или осадка Аа, полученного при производстве гамма- глобулина из сыворотки ретроплацентарной крови, сульфатом аммония, хроматографии и лирфилизэции, о т л и ч а- ю щ и и с я тем, что, с целью сокращения времени процедуры, после обработки сульфатом аммония осадок последовательно подвергают гельфильтрации на сефадексе Г-100 в 0.02 М аммоний-ацетатном буфере, фракции, содержащие целевой продукт, подвергают ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе в том же буфере, отмывку от балластных белков проводят 0,06 М хлоридом натрия и целевой продукт элю- ируют 0,2 М раствором хлорида натрия, затем подвергают его аффинной хроматографии на сефарозе с иммобилизованным цибакрон-синим красителем, отмывают от балластных белков 0,2 М и элюируют 2,0 М раствором хлорида натрия, элюат подвергают гельфильтрации на сефадексе Г-200 в аммоний-бикарбонатном буфере 0,1 М, рН8,0.

Изобретение относится к биологической химии и касается способа получения трофобластического бета 1-гликопротеина. Целью изобретения является сокращение времени. Способ осуществляется путем обработки сыворотки ретроплацентарной крови или осадка As, полученного при производстве гамма-глобулина из сыворотки ретроплацентарной крови, сульфатом аммония, затем осадок растворяют в воде и последовательно подвергают гель-фильтрации на сефадексе Г-100 в 0,02 М аммоний- ацетатном буфере, затем ионообменной хроматографии а ДЕАЕ-целлюлозе, затем подвергают целевой продукт аффинной хроматографии на сефарозе, с иммобилизованным цибакрон-синим и гельфильтрации на сефадексе. Г-200.