Среда покрытия для выявления вирусов по бляшкообразованию Советский патент 1991 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к медицине, в частности к вирусологии, и может быть использовано для индикации и подсчета количества вирусов в вирусных суспензиях и биологических жидкостях.

Известна плотная питательная среда для выявления и изоляции вирусов полиомиелита по бляшкообразованию, включающая в себя растворы Эрла, нейтрального красного, куриный эмбриональный экстракт и агар Дифко.

Недостатком известной среды для выявления вирусов по бляшкообразованию является непригодность агарового покрытия для многих перевиваемых культур клеток, которые быстро дегенерируют и

отслаиваются от стекла. Кроме того, на эффективность выделения и титрования вирусов по бляшкообразованию отрицательное влияние оказывают содержащиеся в агаре вирусные ингибиторы - сульфатированные полисахариды, а также фотодинамическое действие нейтрального красного. Трудоемким и материалоемким является процесс приготовления куриного эмбрионального экстракта и контроль на его стерильность. Существенным недостатком агарового покрытия является сложность его приготовления; отдельное приготовление растворов А и В; необходимость расплавления агара Дифко и нанесение на клетки покрытия с температурой 43 dC (быстрое застывание

о ю -N о

Јь

агара при более низкой температуре); необходимость проведения ряда манипуляций в темноте.

Необходимость использования дорогостоящих термостатов с подачей С02 для поддержания определенных параметров рН среды существенно ограничивает возможности применения метода титрования вирусов под агаровым покрытием.

Известна жидкая питательная среда покрытия, содержащая раствор Эрла, бикарбонат натрия, сыворотку крупного рогатого скота, природный алюмосиликат бентонит.

Недостатками жидкого питательного бентонитового покрытия являются трудоемкость и сложность получения геля бентонита из природного сырья. Природный алюмосиликат бентонит характеризуется нестабильностью химического состава и различной дисперсностью в зависимости от месторождения, что затрудняет получение геля стандартизованного состава, отсутствует также выпуск бентонитового геля в промышленных масштабах.

Цель изобретения - повышение чувствительности и стабильности среды покрытия для выявления вирусов по бляшкообразованию.

Поставленная цель достигается, тем что в раствор Эрла или среду 199 на растворе Эрла вносят бикарбонат натрия, сыворотку крупного рогатого скота и аминозтоксиаэросил с рН покрытия 7,9 при следующем соотношении компонентов, %:

Аминоэтоксиаэросил0,03 - 0,05

Бикарбонат натрия0,2 - 0,3

Сыворотка крупного

рогатого скота3-5

Раствор Эрла или среда

199 на растворе ЭрлаДо 100

Предлагаемую среду покрытия выгодного отличает ее высокая стабильность в течение длительного времени перед ис-1 пользованием (6 мес при температуре хранения 4°С) без изменения свойства как отдельных ее компонентов, так и покрытия в целом. В то же время, агаровое покрытие не обладает стабильностью свойств, так как может быть приготовлено только extempore и его качество, а также качество результатов выявления вирусов по бляшкам зависят от температуры покрытия во время его приготовления и в момент внесения на заражен- ные клеточные культуры (43°С). Бентонитовое питательное покрытие не обладает стабильностью из-за различий физико-химических свойств самого геля бентонита, что связано с месторождением природного сырья, нестандартизированными условиями приготовления бентонитово-

го геля, а также со способностью частиц бентонита агрегироваться в конгломераты при хранении уже готового покрытия.

Функциональное назначение аминоэтоксиаэросила в покрытии для выявления вирусов по бляшкообразованию состоит в локализации вируса на клеточном монослое, абсорбции на своей активной поверхности свободного вируса, который не

0 проник в клетку во время предварительной инкубации вируса и клеток; в абсорбции частиц аминоэтоксиаэросила на поверхности неповрежденных вирусом клеток; а также в визуализации вирусных бляшек на клеточ5 ном монослое без применения дополнительных методик окрашивания клеток: вирусные бляшки представляют собой прозрачные пятна четкой формы и размеров на матово-белом фоне неповрежденных кле0 ток, покрытых аминоэтоксиаэросилом.

П р и м е р 1. Выявление вируса полиомиелита I типа, штамм Lsc12ab.

К 95 мл стерильного раствора Эрла добавляют аминозтоксиаэросил, предвари5 тельно простерилизованный сухим жаром при 160- 170°С в течение 1,5ч, интенсивно встряхивают для образования взвеси, вносят 5 мл сыворотки крупного рогатого скота, предварительно прогретой при 56°С в тече0 ние 1 ч, добавляют бикарбонат натрия. Приготовленная среда покрытия стабильна в течение 6 мес и более и может храниться до применения в бытовом холодильнике. Взвесь клеток Vero при концентрации

5 300 тыс. кл./мл вносят в стерильные пени- циллиновые флаконы и выращивают под резиновыми пробками в течение 24 ч до образования монослоя на дне. Вируссодер- жащий материал или его разведения (деся0 тикратные) вносят во флаконы с клеточным монослоем, инкубируют в термостате при 37°С 60 мин, затем заливают 3 мл среды покрытия. Результаты учитывают через 48 ч после выдерживания в термостате при 37°С.

5 Для учета результатов флакончики переворачивают вверх дном и подсчитывают число прозрачных пятен на молочно-белом фоне неповрежденного клеточного монослоя. Одна бляшка (прозрачное пятно) соответству0 ет одной вирусной частице и выражается как БОЕ (бляшкообразующая единица).

В табл.1 приведены результаты титро- вания полиовируса I типа, штамм Lsc, 2 ab в зависимости от концентрацииаминозтокси5 аэросила и рН в среде покрытия.

П р и м е р 2. Выявление вируса поли- омиелита II типа, штамм Р-712 сп, 2 ab. : К 95 мл стерильного раствора Эрла добавляют аминоэтоксиазросил, предварительно простерилизованный сухим жаром

при 160- 170°С стечение 1,5ч,интенсивно встряхивают для образования взвеси, вносят 5 мл сыворотки KDynnoro рогатого скота, предварительно прогретой при 56°С в течение 1 ч, добавляют бикарбонат натрия. Приготовленная среда покрытия стабильна в течение 6 мес и более и может храниться до применения в бытопом холодильнике.

Взвесь клеток Vero при концентрации 300 тыс.кл./мл вносят в стерильные пени- циллиновые флаконы и выращивают под резиновыми пробками в течение 24 ч до образования на дне монослоя. Вируссодер- жащий материал или его разведения (десятикратные) вносят во флаконы с клеточным монослоем, инкубируют в термостате при 37°С 60 мин, затем залипают 3 мл среды покрытия. Результаты учитывают через 48 ч после выдерживания в термостате при 37°С. Для учета результатов флакончики переворачивают вверх дном и подсчитывают число п-розрачнпх пятен на молочно-белом фоне неповрежденного клеточного монослоя. Одна бляшка (прозрачное пятно) соответствует одной вирусной частице и выражается как БОЕ (бляшкпоб- разующая единица).

В табл.2, приведены результаты титрования полиовируса I типа, штамм Р-712 ch 2 ab в зависимости от концентрации амино- отоксиаэросила и рН в среде покрытия.

П р и м е р 3. Выявление вируса Коксаки В 1, штамм Сопп-5.

К 95 мл стерильного раствора Эрла добавляют аминоэтоксиаэросил, предварительно простерилизованныи сухим жаром при 160- 170°С в течение 1,5ч, интенсивно встряхивают для образования взвеси, вносят 5 мл сыворотки крупного рогатого скота, предварительно прогретой пои 56°С в течение 1 ч, добавляют бикарбонат натрия. Приготовленная среда покрытия стабильна в течение 6 мес и более и может хранится до применения в бытовом холодильнике.

Взвесь клеток Vero при концентрации 300 тыс.кл./мл вносят с стерильные пени- циллиновые флаконы и выращивают под резиновыми пробками в течение 24 ч до образования на дне монослоя. Вируссодер- жащий материал или его разведения (десятикратные) вносят во флаконы с клеточным монослоем, инкубируют в термостате при 37°С 60 мин, затем заливают 3 мл среды покрытия. Результаты учитывают через 48 ч после выдерживания в термостате при 37°С. Для учета результатов флакончики переворачивают вверх дном и подсчитывают число прозрачных пятен на молочно-белом фоне неповрежденного клеточного монослоя. Одна бляшка (прозрачное пятно) соответствует одной вирусной частице и выражается как БОЕ (бляшкообразующая единица).

В табл.3 приведены результаты титровапия вируса Коксаки В 1, штамм Сопп-5 в зависимости от концентрации аминоэтокси- азросила и рН в среде покрытия.

П р м м е р 4. Выявление вируса Коксаки В 3, штамм Nancy.

0 К 95 мл стерильного раствора Эрла добавляют аминозтоксиаэросил, предварительно простерилизованныи сухим жаром при 160 - 170°С в течение 1,5 ч, интенсивно встряхивают для образования взвеси, вно5 сят 5 мл сыворотки крупного рогатого скота, предварительно прогретой при 5б°С в течение i ч, добавляют бикарбонат натрия. Приготовленная среда покрытия стабильна в течение б мес и более и может хранить0 ся до применения в бытовом холодильнике. Взвесь клеток Vero при концентрации 300 тыс.кл,/мл вносят в стерильные пени- циллиновые флаконы и выращивают под резиновыми пробками в течение 24 ч до

5 образования на дне монослоя. Вируссодер- жащий материал или его разведения (десятикратные) вносят во флаконы с клеточным монослоем, инкубируют в термостате при 37°С 60 мин, затем заливают 3 мл среды

0 покрытия. Результаты учитывают через 48 ч после выдерживания в термостате при37°С Для учета результатов флакончики переворачивают вверх дном и подсчитывают число прозрачных пятен на молочно-белом фоне

5 неповрежденного клеточного монослоя. Одна бляшка (прозрачное пятно) соответствует одной вирусной частице и выражается как БОЕ (бляшкообразующая единица). В та5л,4 приведены результаты титро0 вания вируса Коксаки В 3, штамм Nancy в зависимости от концентрации аминоэтокси- аэросила и рН в среде покрытия.

П р и м е р 5. Выявление вируса Коксаки В 6, штамм Schmitt.

5 К 95 мл стерильного раствора Эрла добавляют аминоэтоксиаэросил, предварительно простерилизованныи сухим жаром при 160-170°С в течение 1,5ч., интенсивно встряхивают для образования взвеси, вно0 сят 5 мл сыворотки крупного рогатого скота, предварительно прогретой при 5б°С в течение 1 ч. добавляют бикарбонат натрия. Приготовленная среда покрытия стабильна в течение б мес и более и может хранится до

5 применения в-бытовом холодильнике.

Взвесь клеток Vero при концентрации 300 тыс.кл/мл вносят в стерильные пени- циллиновые флаконы и выращивают под резиновыми пробками в течение 24 ч до образования на дне монослоя, Десятикратные разведения вируса Коксаки В О, штамм Schmitt вносят во флаконы с клеточным монослоем, инкубируют в термостате при 37°С 60 мин, затем залипают 3 мл среды покрытия. Результаты учитывают через A3 ч после выдерживания в термостате при 37°С. Для учета результатов флакончики переворачивают вверх дном и учитывают число прозрачных пятен на молочно-белом фоне неповрежденного клеточного монослоя. Одна бляшка (прозрачное пятно) соответствует одной вирусной частице и выражается как БОЕ (бляшкообразующая единица).

В табл.5 приведены результаты титро- пания-вируса Коксаки В 6, штамм Schmitt в зависимости от концентрации аминоэтокси- аэросила и рН в среде покрытия.

Пример 6. Выявление вируса Коксаки В G, штамм Mammon.

К 95 мл стерильного раствора Эрла добавляют амино токсиазросил, предварительно простерилизованный сухим жаром при 160-170°С в течение 1,5 ч, интенсивно встряхивают для образования взвеси, вносят 5 мл сыворотки крупного рогатого ско- ia, предварительно прогретой при 56°С в течение 1 ч, добавляют бикарбонат натрия. Приготовленная среда покрытия стабильна в течение 6 меси более и может хранится до применения в бытовом холодильнике.

Взвесь клеток Нер-2 при концентрации 300 тыс.кл./мл вносят в стерильные пени- циллиновые флаконы и выращивают под резиновыми пробками в течение 24 ч до образования на дне монослоя. Десятикратные разведения вируса Коксаки В 6, штамм Hammon вносят во флаконы с клеточным монослоем, инкубируют в термостате при 37°С 60 мин, затем заливают 3 мл среды покрытия. Результаты учитывают через 48 ч после выдерживания в термостате при- 37°С. Для учета результатов флакончики переворачивают вверх дном и учитывают число прозрачных пятен на молочно-белом фоне неповрежденного клеточного монослоя, Одна бляшка (прозрачное пятно) соответствует одной вирусной частице и выражается как БОЕ (бляшкообразующая единица).

В табл.6 приведены результаты титрования вируса Коксаки В б, штамм Hammon в зависимости от концентрации аминозток- сиаэросила и рН в среде покрытия.

Пример. Выявление вируса везикулярного стоматита, штамм Индиана.

К 95 мл стерильного раствора Эрла добавляют аминозтоксиаэросил предвари- тельно простерилизованный сухим жаром при 160 - 170°С о течение 1,5 ч, интенсивно встряхивают для образования взвеси, вносят 5 мл сыворотки крупного рогатого скота, предварительно прогретой при 56°С в тече- ние 1 ч, добавляют бикарбонат натрия. Приготовленная среда покрытия стабильна в течение 6 мес и более и может хранится о бытовом холодильнике до применения.

Взвесь клеток Нер-2 при концентрации 300 тыс.кл,/мл вносят в стерильные.пени- циллиновые флаконы и выращивают под резиновыми пробками в течение 24 ч до образования на дне монослоя. Десятикратные разведения вируса везикулярного сто- матита, штамм Индиана вносят во флаконы с клеточным монослоем, инкубируют D термостате при 37°С 60 мин, затем заливают 3 мл среды покрытия. Результаты учитывают через 48 ч после выдерживания в термо- стате при 37°С. Для учета результатов флакончики переворачивают вверх дном и учитывают число прозрачных пятен на молочно-белом фоне неповрежденного монослоя. Одна бляшка (прозрачное п ятно) соответствует одной вирусной частице и выражается как БОЕ (бляшкообразующая единица).

В табл.7 приведены результаты титрования вируса везикулярного стоматита, штамм Индиана в зависимости от концентрации аминоэтоксиаэросила и рН в среде покрытия.

Формула изобретения Среда покрытия для выявления вирусов по бляшкообразованию, содержащая раствор Эрла, или среду 199 на растворе Эрла, сыворотку крупного рогатого скота, бикарбонат натрия, отличающаяся тем, что, с целью повышения чувствительности и стабильности среды, она дополнительно содержит аминоэтоксиаэросил при следующих соотношениях компонентов: Аминоэтоксиаэросил0,03-0,05мас.% Бикарбонат натрия0,2-0,3об.% . Сыворотка крупного

рогатого скота3,0-5,0 об.%

Раствор Эрла или среда 199 на растворе Эрла До 100 об.%

Таблица 1

Изобретение относится к медицине, в частности к вирусологии, и может быть использовано для индикации и подсчета количества вирусов в вирусных суспензиях и биологических жидкостях. Цель изобретения - повышение чувствительности и стабильности среды покрытия для выявления вирусов по бляшкообразованию. Предлагаемая среда покрытия для выявления вирусов по бляшкообразованию, содержащая раствор Эрла или среду 199 на растворе Эрла, сыворотку крупного рогатого скота, бикарбонат натрия, отличается тем, что она дополнительно содержит аминоэтоксиаэро- сил при следующем соотношении компонентов: аминоэтоксиаэросил 0,03 - 0,05 мас.%; бикарбонат натрия 0,2 - 0,3 об. %; сыворотка крупного рогатого скота 3,0 - 5.0 об.%; раствор Эрла или среда 199 на растворе Эрла до 100,0 об.%. 7 табл. СО

Примечание,

X - vu

умет невозможен из-за неспецифической дегенерации клеточного монослоя;

хх - учет затруднен из-за низкой концентрации аминоэтоксиаэросила в среде (не хватает сорбента для покрытия всего монослоя).

Примечание.

х - учет невозможен из-за неспецифической дегенерации клеточного

монослоя;

хх - учет затруднен из-за низкой концентрации аминоэтоксиаэросила в среде (не хватает сорбента лля покрытия.всего монослоя).Таблица 3

1 /х - учет невозможен из-за неспецифической дегенерации клеточного

хх - СмеТмтруднен из-за низкой концентрации аминоэтоксиаэросила в соеде (не хватает сорбента для покрытия всего монослоя).

Таблица 2

Таблица 4

Примечани-е.

х - учет невозможен из-за неспецифической регенерации клеточного

мокослоя;

хх - учет затруднен из-за низкой концентрации аминоэтоксиаэросилэ Т а б Л И Ц Э 6 в среде (не хватает сорбента для покрытия всего монослоя}.

Примечание,

х - учет невозможен из-за неспецийической дегенерации клеточного

моно-слоя;

хх - учет затруднен из-за низкой концентрации аминоэтоксиаэросила в cpe/ie (не хватает сорбента для покрытия всего монослоя).

Примечание, х-учет невозможен из-за неспецифической дегенерации клеточного

монослоя

хх-учет затруднен из-за низкой концентрации аминоэтоксиаэросила в среде (не хватает сорбента для покрытия всего монослоя).

Редактор М.ПетроваТехред М.Моргентал

Заказ 4130ТиражПодписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Таблица 5

Таблица 7

Корректор М.Демчик