Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и медицины и, в частности, касается способа модулирования роста клеток и, более точно, способа подавления роста неопластических клеток. Настоящее изобретение может быть использовано, среди прочего, при терапевтическом и/или профилактическом лечении таких раковых заболеваний, как твердые опухоли: рак толстой кишки, желудка, легких, мозга, костей, пищевода, поджелудочной железы, молочной железы, яичников или матки, но не ограничивается ими.
Уровень техники
Развернутая библиография публикаций, на которые ссылается автор в настоящем описании, собрана в конце описания.
Ссылки на предшествующий уровень техники в настоящем описании не являются и не должны восприниматься как признание или предположение в любой другой форме, будто предшествующий уровень техники образует составную часть общепринятых знаний в Австралии.
Сфингозинкиназа является ключевым регуляторным ферментом в целом ряде клеточных реакций. Известно, что сфингозин-1-фосфат является важным вторичным посредником при передаче сигналов (Meyer et al., 1997). В различных типах клеток он обладает митогенным эффектом (Alessenko, 1998) и, по-видимому, запускает ряд важных регуляторных путей, включая предотвращение индуцированного церамидами апоптоза (Culliver et al., al., 1996), мобилизацию внутриклеточного кальция независимым от IP3 путем, стимуляцию синтеза ДНК, активацию протеинкиназного (МАР-киназного) пути, активируемого митогенами, активацию фосфолипазы D и регуляцию подвижности клеток (см. обзоры: Meyer et al., 1997; Spiegal et al., 1998; Igarashi, 1997).
Недавние исследования (Xia et al., 1998) показали, что сфингозин-1-фосфат является непременным промежуточным сигнальным соединением при воспалительных ответах эндотелиальных клеток на α-фактор некроза опухолей (αTNF). Несмотря на его очевидное значение, очень мало известно о механизмах, контролирующих уровень сфингозин-1-фосфата в клетках. Известно, что уровень сфингозин-1-фосфата в клетке в основном определяется его образованием из сфингозина под действием сфингозинкиназы и в меньшей степени его разрушением связанной с эндоплазматическим ретикулумом сфингозин-1-фосфатлиазой и сфингозин-1-фосфатфосфатазой (Spiegal et al., 1998). Базальные уровни сфингозин-1-фосфата в клетке обычно невелики, но могут быстро и временно возрастать, когда клетка подвергается воздействию митогенов. Такая реакция, по-видимому, коррелирует с увеличением активности сфингозинкиназы в цитозоле и может быть предотвращена добавлением ингибирующих сфингозинкиназу молекул N,N-диметилсфингозина и DL-трет-дигидросфингозина. Это означает, что сфингозинкиназа является важной молекулой, ответственной за регуляцию уровня сфингозин-1-фосфата в клетке. Таким образом, сфингозинкиназа играет главную и непременную роль в осуществлении эффектов, приписываемых сфингозин-1-фосфату в клетке.
Предполагается, что сфингозинкиназа играет роль в ряде клеточных активностей, включая воспаление, мобилизацию кальция, подвижность и экспрессию молекул адгезии. Однако точную природу регулируемых таким образом клеточных активностей, роль и механизм действия сфингозинкиназы в этом отношении только сейчас начинают понимать. Многие сигналы, ведущие к модуляции различных клеточных активностей, еще точно не определены. Выяснение таких сигнальных клеточных механизмов необходимо для разработки терапевтических и профилактических подходов к заболеваниям, в которых участвуют ошибочные или иным образом нежелательные клеточные активности.
В работе, которая привела к настоящему изобретению, авторы определили, что сигнальный каскад, стимулируемый одной из липидкиназ, сфингозинкиназой, играет важную роль в онкогенезе и, фактически, она сама по себе онкогенна, когда уровень ее активности слишком высок. Даже в свете предварительных данных, указывающих на роль сфингозинкиназы в различных клеточных активностях, онкогенное действие сфингозинкиназы неожиданно и полностью непредвиденно для этой молекулы. Установление связи между сфингозинкиназой и патогенезом рака дает возможность рационально разрабатывать терапевтический и/или профилактический режим для модуляции роста клеток, а также идентифицировать те молекулы, которые можно использовать для модуляции роста клеток.
Сущность изобретения
В настоящем описании и следующей за ней формуле изобретения, если по контексту не требуется иной смысл, слово "включает" и его варианты типа "включают" и "включающий" следует понимать как включение указанного предмета или стадии, либо группы предметов или стадий, без исключения любых других предметов или стадий либо групп предметов или стадий.
Один из вариантов настоящего изобретения предусматривает способ модуляции роста клеток, включающий обработку клеток эффективным количеством средства в течение времени и в условиях, достаточных для модулирования активности сфингозинкиназы.
Другой вариант настоящего изобретения предусматривает способ модуляции роста клеток, включающий обработку клеток эффективным количеством средства в течение времени и в условиях, достаточных для изменения уровня функциональной активности сфингозинкиназы.
Следующий вариант настоящего изобретения предусматривает способ модуляции размножения (пролиферации) клеток, включающий их обработку эффективным количеством средства в течение времени и в условиях, достаточных для изменения уровня функциональной активности сфингозинкиназы.
Следующий вариант настоящего изобретения предусматривает способ подавления (down-regulating) пролиферации клеток, включающий их обработку эффективным количеством средства в течение времени и в условиях, достаточных для подавления функциональной активности сфингозинкиназы.
Следующий вариант настоящего изобретения предусматривает способ усиления (up-regulating) пролиферации клеток, включающий их обработку эффективным количеством средства в течение времени и в условиях, достаточных для усиления функциональной активности сфингозинкиназы.
В следующем варианте настоящего изобретения предусматривается способ подавления пролиферации неопластических клеток, включающий их обработку эффективным количеством средства в течение времени и в условиях, достаточных для подавления функциональной активности сфингозинкиназы.
Следующий вариант настоящего изобретения предусматривает способ усиления пролиферации клеток, включающий их обработку эффективным количеством средства в течение времени и в условиях, достаточных для усиления функциональной активности сфингозинкиназы.
Следующий вариант настоящего изобретения предусматривает способ лечения и/или профилактики заболеваний, характеризующихся неконтролируемым ростом клеток у млекопитающих, который включает введение млекопитающим эффективного количества средства в течение времени и в условиях, достаточных для подавления функциональной активности сфингозинкиназы.
Следующий вариант настоящего изобретения касается лечения и/или профилактики неопластических заболеваний у млекопитающих способом, который включает введение млекопитающим эффективного количества средства в течение времени и в условиях, достаточных для подавления функциональной активности сфингозинкиназы.
Следующий вариант настоящего изобретения касается применения средства, способного модулировать функциональную активность сфингозинкиназы, при изготовлении медикамента для модулирования роста клеток у млекопитающих, в котором подавление функциональной активности сфингозинкиназы ведет к подавлению роста данных клеток, а усиление функциональной активности сфингозинкиназы ведет к усилению роста данных клеток.
Следующий вариант касается средств, предназначенных для модуляции функциональной активности сфингозинкиназы, при котором модулирование функциональной активности сфингозинкиназы ведет к модуляции роста клеток.
В следующем варианте настоящее изобретение касается фармацевтической композиции, включающей модуляторное средство, определенное выше, и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей и/или разбавителей. Указанные модуляторные средства называются активными ингредиентами.
Следующий вариант настоящего изобретения касается модуляторных средств, определенных выше, при их применении в способе настоящего изобретения.
Следующий вариант настоящего изобретения касается способа диагностики, который основывается на скринировании (обследовании) лиц на присутствие сфингозинкиназы, либо мРНК или белка, либо специфических форм сфингозинкиназы, транскрибируемых и/или транслируемых в данной популяции клеток. Методика скринирования может быть направлена на количественный и/или качественный анализ сфингозинкиназы. Это особенно полезно, например, при определении того, будет ли данное лицо предрасположено или устойчиво к заболеваниям, при которых ненормальный, нежелательный или иным образом ненадлежащий рост клеток является компонентом заболевания, и/или будет ли оно предрасположено или устойчиво к развитию определенных форм ненормального, нежелательного или иным образом ненадлежащего роста клеток.
Перечень фигур
На фиг.1 графически представлена суперэкспрессия SphK в клетках NIH 3Т3. (А) Цитоплазматическую активность SphK измеряли в клетках, устойчиво трансфецированных pcDNA3-SphK-FLAG (SK-3T3) или исходным вектором (N-3T3). (В) Внутриклеточный уровень S1P измеряли в меченных [3H]-сфингозином образцах клеток SK-3T3 или N-3T3. (С) Белки в растворимой фракции лизированных клеток подвергали гибридизации с моноклональными антителами против FLAG (M2, Kodak).
На фиг.2 графически представлено, как суперэкспрессия SphK усиливает пролиферацию клеток NIH 3Т3. (А) Кривые роста показывают, что клетки SK-3T3 (правая секция) размножаются быстрее, чем клетки N-3T3 (левая секция). Приведены средние значения из тройных измерений и близкие результаты были получены в трех независимых экспериментах. (В) Рост клеток при насыщающей плотности. Клетки подсчитывали при полном насыщении (белые столбцы) и через 24 часа после насыщения (черные столбцы), соответственно. (С) DMS ингибирует пролиферацию клеток при суперэкспрессии SphK. Равное число клеток SK-3T3 и N-3T3 культивировали в среде DMEM, содержащей 10% сыворотки, в присутствии или в отсутствие DMS (2,5 мкМ) в течение 5 дней. Среду заменяли каждый день. Данные в (В) и (С) представляют средние значения ±S.D. из трех независимых экспериментов по трем измерениям.
На фиг.3 показана суперэкспрессия SphK при трансформации клеток NIH ЗТЗ. (А) Образование очагов трансфецированных клеток NIH 3Т3. Культуры трансфецировали SphK (SK-3T3) или одним вектором (N-3T3) и фотографировали через 12 дней после транфекции (увеличение ×40). (В) Образование колоний на мягком агаре. Клетки SK-3T3 и N-3T3 культивировали в среде, содержащей 0,33% агара, и добавляли среду с различными концентрациями DMS через каждые 2 дня. Снимки получены после 2 недель культивирования и окрашивания МТТ. (С) Клетки NIH ЗТЗ трансфецировали V12-Ras или v-Src и измеряли активность SphK через 48 ч после трансфекции. (D) Анализ образования очагов проводили на клетках NIH 3Т3, трансфецированных V12-Ras, v-Src или SphK, в отсутствие или в присутствии DMS (2,5 мкМ) на протяжении 2 недель.
На фиг.4 показано, что суперэкспрессия SphK в клетках вызывает образование опухолей. (А) Фотография опухолей у мышей NOD/SCID, которым были введены клетки NIH 3Т3, трансфецированные SphK. (В) Морфология опухоли (вставка) и фиксированные в парафине срезы, окрашенные гематоксилином и эозином (увеличение ×60). (С) Экстракты целых клеток из трех отдельных опухолей (дорожки 4-6) и их периферических тканей (дорожки 1-3), клеток N-3T3 (дорожка 7) и SK-3T3 (дорожка 8) анализировали методом Westem-гибридизации. Верхнюю часть мембраны подвергали гибридизации с антителом против FLAG, а нижнюю - с антителом против актина (Santa Cruz).
Подробное раскрытие изобретения
Настоящее изобретение основывается, в частности, на установлении корреляции между клеточным ростом, в частности онкогенезом, и модуляцией уровня активности сфингозинкиназы. Установлении такой корреляции позволяет определить и рационально разработать методологию и препараты для применения в терапии, профилактике и диагностике заболеваний, характеризующихся ненормальным, нежелательным или иным образом ненадлежащим ростом клеток, в частности, неконтролируемой, индуцированной онкогенами пролиферации.
Соответственно, один из вариантов настоящего изобретения предусматривает способ модуляции роста клеток, включающий их обработку эффективным количеством некоего средства в течение времени и в условиях, достаточных для модулирования функциональной активности сфингозинкиназы.
Под "сфингозинкиназой" следует понимать все формы сфингозинкиназы и ее производных, гомологов, аналогов, эквивалентов или миметиков, или другие молекулы, обладающие функцией сфингозинкиназы, и молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие производные, гомологи, аналоги, эквиваленты или миметики сфингозинкиназы. К ним относятся, например, все белковые или нуклеотидные формы сфингозинкиназы или ее функциональных производных, гомологов, аналогов, эквивалентов или миметиков, включая, к примеру, любые изоформы, возникающие при альтернативном сплайсинге мРНК сфингозинкиназы, или мутанты или полиморфные варианты сфингозинкиназы. Следует также иметь в виду, что термин "нуклеотидная форма сфингозинкиназы" означает нуклеиновую кислоту, кодирующую сфингозинкиназу, и включает все регуляторные элементы сфингозинкиназы (типа промоторов или энхансеров), которые регулируют экспрессию сфингозинкиназы, включая регуляторные элементы, находящиеся в положениях, отличных от положения между сайтами инициации и терминации транскрипции в геномной ДНК, кодирующей сфингозинкиназу. Под "сфингозинкиназой" также следует понимать и все другие молекулы, обладающие функциональной активностью сфингозинкиназы. К таким молекулам относятся, например, эндогенно экспрессируемые молекулы, обладающие функциональной активностью сфингозинкиназы, или молекулы, которые были введены в организм и проявляют по меньшей мере одну из функций сфингозинкиназы. Эти молекулы могут быть рекомбинантными, искусственными или природными. Если не указано иначе, любые ссылки на модуляцию активности сфингозинкиназы включают модуляцию экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей сфингозинкиназу, или функциональной активности продукта экспрессии сфингозинкиназы, и следует иметь в виду, что они также включают модуляцию экспрессии или функциональной активности, либо функционального эквивалента или производного сфингозинкиназы.
Под "модуляцией функциональной активности" сфингозинкиназы следует понимать усиление, подавление или любое другое изменение одной или нескольких функциональных активностей сфингозинкиназы. Она включает, к примеру, модуляцию проявления одной или более функциональных активностей сфингозинкиназы, модуляцию скорости, с которой данная активность проявляется, модуляцию степени, с которой такая активность проявляется, модуляцию количества активностей, способных проявиться, или модуляцию роли или степени, с которой проявляется любая из активностей, или природы активности. Изменения активности сфингозинкиназы могут осуществляться разными путями, включая посттрансляционную модификацию, связывание белков или других молекул, или трансляцию, но не ограничиваясь этим. Модуляцию активности следует также понимать как повышение или снижение концентрации сфингозинкиназы (например, при модуляции экспрессии сфингозинкиназы). В предпочтительном воплощении функциональная активность означает уровень активности сфингозинкиназы.
Соответственно, данное изобретение более предпочтительно касается способа модуляции роста клеток, включающего их обработку эффективным количеством некоего средства в течение времени и в условиях, достаточных для модулирования уровня функциональной активности сфингозинкиназы.
Как описано выше, настоящее изобретение основывается на установлении корреляции между функциональной активностью сфингозинкиназы и ростом клеток, в частности, онкогенной пролиферацией клеток. Не ограничивая настоящее изобретение какой-то одной теорией или механизмом действия, авторы обнаружили, что сигнальный каскад, стимулируемый одной из липидкиназ - сфингозинкиназой, играет важную роль в онкогенезе. В частности, конститутивная активация сфингозинкиназы при повышении экспрессии в клетках приводит к трансформации клеток и образованию опухолей, тем самым указывая на то, что липидкиназа дикого типа человека сама по себе онкогенна. Более того, сфингозинкиназа также участвует в трансформации, индуцированной Ras, но не v-Src. Наконец, ингибирование активности сфингозинкиназы с помощью ингибитора сфингозинкиназы обращает трансформацию не только в клетках с повышенным уровнем экспрессии сфингозинкиназы, но также и в Ras-трансформированных клетках. В этой связи "модуляцию" роста клеток следует понимать как усиление или подавление клеточного роста. Более точно, "подавление" роста клеток следует понимать как предотвращение, снижение или ингибирование иным способом одного или нескольких аспектов клеточного роста (включая индукцию апоптоза или гибели клеток другим способом), тогда как "усиление" роста клеток следует понимать в противоположном смысле. "Рост" клеток следует понимать в самом широком смысле, включая все аспекты деления/пролиферации и/или дифференцировки клеток. В особенно предпочтительном воплощении рост означает пролиферацию (размножение).
Согласно этому предпочтительному варианту предусматривается способ модуляции пролиферации клеток, включающий их обработку эффективным количеством некоего средства в течение времени и в условиях, достаточных для модулирования функциональной активности сфингозинкиназы.
Более предпочтительно, предусматривается способ подавления пролиферации клеток, включающий их обработку эффективным количеством некоего средства в течение времени и в условиях, достаточных для подавления функциональной активности сфингозинкиназы.
В другом предпочтительном варианте предусматривается способ усиления пролиферации клеток, включающий обработку клеток эффективным количеством некоего средства в течение времени и в условиях, достаточных для усиления функциональной активности сфингозинкиназы.
В самом предпочтительном варианте пролиферация представляет собой неконтролируемую пролиферацию, как в случае пролиферации, вызванной трансформацией клеток. Предпочтительно такая трансформация вызвана усилением активности онкогена типа Ras или онкогенным действием суперэкспрессии сфингозинкиназы.
Предпочтительно функциональная активность означает уровень функциональной активности сфингозинкиназы.
Следует иметь в виду, что "клетка" в контексте настоящего изобретения означает любой тип клеток, независимо от их происхождения. Например, клетка может быть клеткой естественного происхождения, нормальной или с отклонениями от нормы, либо она может быть искусственной, модифицированной или иным образом обработанной in vivo или in vitro, например, замороженной/оттаянной или генетически, биохимически или иным образом обработанной in vivo или in vitro (включая, к примеру, клетки, полученные в результате слияния двух различных типов клеток). Предпочтительно клетка представлена неопластической клеткой. Под "неопластической клеткой" подразумевается клетка с неконтролируемой пролиферацией. Неопластическая клетка может быть доброкачественной или злокачественной клеткой. Предпочтительно клетка является злокачественной. В одном из предпочтительных воплощений неопластическая клетка является злокачественной клеткой, пролиферация которой может привести к образованию твердых опухолей, например, злокачественной клеткой, происходящей из толстой кишки, желудка, легких, мозга, кости, пищевода или поджелудочной железы.
Согласно этому наиболее предпочтительному варианту, предусматривается способ подавления пролиферации неопластических клеток, включающий их обработку эффективным количеством средства в течение времени и в условиях, достаточных для подавления функциональной активности сфингозинкиназы.
Предпочтительно, неопластическая клетка является злокачественной клеткой, происходящей из толстой кишки, желудка, легких, мозга, кости, пищевода или поджелудочной железы, молочной железы, яичников или матки.
Более предпочтительно, когда злокачественная клетка становится трансформированной либо в результате усиления активности онкогена типа Ras, либо вследствие онкогенного действия суперэкспрессии сфингозинкиназы.
Еще более предпочтительно, когда фукнциональная активность означает уровень функциональной активности сфингозинкиназы.
Следует иметь в виду, что обработка клеток способом настоящего изобретения может проводиться ex vivo или in vivo. "Ex vivo" означает, что клетка была выделена из организма, и тогда модуляция ее роста может осуществляться in vitro. Например, клетка может не быть неопластической, при этом ее иммортализуют путем усиления активности сфингозинкиназы. В соответствии с предпочтительными вариантами настоящего изобретения клетка может быть неопластической клеткой, например злокачественной, локализованной in vivo (к примеру, в толстой кишке), и подавление ее роста будет осуществляться способом настоящего изобретения in vivo путем снижения уровня функциональной активности сфингозинкиназы. Следует также иметь в виду, что в случае указания специфического типа клеток, локализованных in vivo, например злокачественных клеток толстой кишки, такие клетки могут находиться в толстой кишке больного. Если первичная опухоль толстой кишки дает метастазы, то клетки толстой кишки могут находиться в другой части тела пациента. Например, они могут образовать вторичную опухоль (метастаз), находящийся, к примеру, в печени, лимфатическом узле или в кости.
Хотя предпочтительный способ заключается в подавлении пролиферации неопластических клеток, например, в качестве средства лечения рака, однако может быть желательно и усиление роста клеток. Например, может понадобиться иммортализировать популяцию клеток in vitro, чтобы облегчить их долговременное применение in vitro, к примеру, для облегчения роста in vitro таких тканей, как кожная ткань. В другом случае может понадобиться адаптировать клеточную линию к менее разборчивым условиям роста, например к росту при низком содержании сыворотки.
Согласно этому предпочтительному варианту, настоящее изобретение предусматривает способ усиления пролиферации клеток, включающий их обработку эффективным количеством некоего средства в течение времени и в условиях, достаточных для усиления функциональной активности сфингозинкиназы.
Предпочтительно функциональная активность означает уровень функциональной активности сфингозинкиназы.
Не ограничивая данный вариант настоящего изобретения какой-то одной теорией или механизмом действия, усиление пролиферации клеток предпочтительно заключается в трансформации клеток путем усиления онкогенного действия сфингозинкиназы.
В этом отношении "эффективное количество" означает количество, необходимое для того, чтобы по крайней мере частично достичь желаемого результата, или отсрочить возникновение, подавить развитие или полностью остановить развитие заболевания, подвергаемого лечению. Это количество зависит, конечно, от конкретного заболевания, подвергаемого лечению, от тяжести заболевания и индивидуальных параметров больного, включая возраст, физическое состояние, размер, вес и сопутствующее лечение. Эти факторы хорошо известны специалистам в этой области и могут быть учтены простым подбором. Обычно предпочтительно применять максимальные дозы, то есть наиболее высокие безопасные дозы по здравому врачебному суждению. Следует только иметь в виду, что можно вводить пониженные или переносимые дозы по медицинским показаниям, психологическим показаниям или практически по любым другим причинам.
Модуляция активности сфингозинкиназы путем введения средства в клетку может осуществляться одним из нескольких методов, включая, но никоим образом не ограничиваясь этим, введение в клетку средства (когда оно является белковой или небелковой молекулой), которое прямо или косвенно:
(i) модулирует экспрессию сфингозинкиназы;
(ii) модулирует функциональную активность продукта экспрессии сфингозинкиназы.
В этом случае модуляция функциональной активности сфингозинкиназы может осуществляться любым из нескольких методов, включая, но никоим образом не ограничиваясь этим, введение в клетку средства (когда оно является белковой или небелковой молекулой), которое прямо или косвенно:
(iii) модулирует синтез сфингозинкиназы;
(iv) действует как антагонист сфингозинкиназы;
(v) действует как агонист сфингозинкиназы (включая введение продукта экспрессии самой сфингозинкиназы или ее функционального эквивалента, производного, гомолога, аналога или миметика).
Такие белковые молекулы могут происходить из природных, рекомбинантных или искусственных источников, включая слитые белки или полученные, к примеру, при скринировании природных продуктов. Небелковые молекулы могут быть получены из природных источников, например, при скринировании природных продуктов, или могут быть синтезированы. В настоящем изобретении рассматриваются химические аналоги сфингозинкиназы, способные действовать как агонисты или антагонисты сфингозинкиназы. Химические агонисты не обязательно должны происходить из сфингозинкиназы, они могут иметь с нею лишь определенное конформационное сходство. Альтернативно, химические агонисты могут быть разработаны конкретно для воспроизведения определенных физико-химических свойств сфингозинкиназы. Антагонистами могут быть любые соединения, способные блокировать, ингибировать или иным образом предотвращать осуществление нормальных биологических функций сфингозинкиназы (например, N,N-диметилсфингозин или DL-трео-дигидросфингозин). К антагонистам относятся и моно-клональные антитела, специфические к сфингозинкиназе или к части сфингозинкиназы, и антисмысловые нуклеиновые кислоты, предотвращающие транскрипцию или трансляцию генов или мРНК в соответствующих клетках. Модуляция экспрессия также может осуществляться с помощью антигенов, РНК, рибосом, ДНК-ферментов, РНК-аптамеров, антител или молекул, пригодных для косупрессии.
Такие белковые или небелковые молекулы могут действовать как прямо, так и косвенно, модулируя экспрессию сфингозинкиназы или активность продукта экспрессии сфингозинкиназы. Молекула действует непосредственно, если она связывается с молекулой нуклеиновой кислоты или продукта экспрессии сфингозинкиназы, модулируя экспрессию или активность. Молекула действует косвенно, если она связывается с другой молекулой, отличной от нуклеиновой кислоты или продукта экспрессии сфингозинкиназы, причем эта другая молекула прямо или косвенно модулирует экспрессию или активность молекулы нуклеиновой кислоты или продукта экспрессии сфингозинкиназы. Соответственно, способ настоящего изобретения охватывает регуляцию экспрессии молекул нуклеиновой кислоты или функциональной активности продукта экспрессии сфингозинкиназы путем индукции каскада регуляторных процессов.
Не ограничивая действие настоящего изобретения какой-то одной теорией или механизмом действия, отметим тот факт, что сфингозинкиназа функционирует через сигнальный путь, который обычно называют сфингозинкиназным путем. "Сфингозинкиназный сигнальный путь" определяется как путь, функционирующий посредством сфингозинкиназы. При косвенной модуляции функциональной активности сфингозинкиназы следуте иметь в виду, что цель изобретения достигается модулированием активности компонентов сфингозинкиназного сигнального пути, действующих до или после сфингозинкиназы, в той мере, в какой они составляют часть этого пути. Например, модуляцию "сфингозинкиназной активности" можно осуществить посредством:
(i) модуляции каталитической активности сфингозинкиназы путем конкуренции за субстрат (к примеру, сфингозин или АТФ);
(ii) влияния на каталитическую активность сфингозинкиназы через аллостерические механизмы (при связывании с сайтами этой молекулы, отличными от сайтов связывания субстрата);
(iii) влияния на активацию фермента, например, при изменении:
- посттрансляционной ковалентной модификации - фосфорилирования, модификации липидов,
- нековалентного присоединения необходимого коактиватора - белка, липида или иона,
- субклеточной локализации фермента.
К "производным" относятся фрагменты, части, порции, мутанты, варианты и миметики из природных, искусственных или рекомбинантных источников, включая слитые белки. К частям или фрагментам относятся, к примеру, активные участки сфингозинкиназы. Производные можно получить путем вставки, делеции или замены аминокислот. Производные, полученные в результате вставки аминокислот, включают слияния со стороны амино и/или карбоксильного конца, а также вставки одной или нескольких аминокислот внутри последовательности. Варианты, возникшие в результате аминокислотных вставок, включают такие, у которых в заранее определенный сайт белка вставлена одна или несколько аминокислот, хотя возможны и вставки в случайные сайты с последующим скринированием конечного продукта. Варианты с делециями характеризуются удалением одного или более аминокисотных остатков из последовательности. Варианты с заменой аминокислот характеризуются тем, что удаляется по меньшей мере один аминокислотный остаток и на его место вставляется остаток другой аминокислоты. Примером вариантов с заменой аминокислоты служат консервативные замены аминокислот. Консервативные замены аминокислот в обычных случаях включают замены внутри следующих групп: глицин и аланин; валин, изолейцин и лейцин; аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; аспарагин и глутамин; серин и треонин; лизин и аргинин; фенилаланин и тирозин. Добавления к аминокислотным последовательностям включают слияния с другими пептидами, полипептидами или белками.
Термин "гомологичный" следует понимать как молекулы нуклеиновой кислоты или белка сфингозинкиназы, происходящие из видов, отличных от рассматриваемых видов.
Химические и функциональные эквиваленты молекул нуклеиновой кислоты или белка сфингозинкиназы следует понимать, как молекулы, обладающие хотя бы одной из функциональных активностей этих молекул, и они могут быть получены из любого источника, например, синтезированы химическим путем или идентифицированы при скринировании, к примеру, природных продуктов.
К производным относятся и фрагменты с определенными эпитопами или части целого белка, слитые с пептидами, полипептидами или другими белковыми или небелковыми молекулами.
Рассматриваемые в настоящем изобретении аналоги включают, не ограничиваясь этим, модификации боковых цепей, включение искусственных аминокислот и/или их производных во время синтеза пептида, полипептида или белка, и использование поперечных сшивок и других методов, накладывающих конформационные ограничения на белковые молекулы или их аналоги.
Производные последовательностей нуклеиновых кислот могут быть получены аналогичным образом посредством единичных или множественных замен нуклеотидов, делеций и/или вставок, включая слияние с другими молекулами нуклеиновых кислот. К производным молекул нуклеиновых кислот настоящего изобретения относятся олигонуклеотиды, праймеры для ПЦР, антисмысловые молекулы, молекулы, пригодные для косупрессии, и слитые молекулы нуклеиновых кислот. К производным нуклеотидных последовательностей также относятся вырожденные варианты.
Рассматриваемые в настоящем изобретении примеры модификаций боковой цепи включают модификации аминокислотных групп: восстановительное алкилирование при реакции с альдегидом с последующим восстановлением NaBH4; амидирование с помощью метилацетимидата; ацилирование уксусным ангидридом; карбамоилирование аминогрупп цианатом; тринитробензилирование аминогрупп с помощью 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты (TNBS); ацилирование аминогрупп янтарным ангидридом и тетрагидрофталевым ангидридом; и пиридоксилирование лизина пирдоксаль-5-фосфатом с последующим восстановлением NaBH4.
Гуанидиновые группы остатков аргинина могут быть модифицированы путем образования продуктов гетероциклической конденсации с такими реагентами, как 2,3-бутандион, фенилглиоксаль и глиоксаль.
Карбоксильные группы могут быть модифицированы путем активации карбодиимидом с образованием О-ацилизомочевины и последующей дериватизацией, например, до соответствующего амида.
Сульфгидрильные группы могут быть модифицированы такими методами, как карбоксиметилирование иодуксусной кислотой или иодацетамидом; окисление пероксимуравьиной кислотой до цистеиновой кислоты; образование смешанных дисульфидов с другими тиоловыми соединениями; реакция с малеимидом, малеиновым ангидридом или другим замещенным малеимидом; образование ртутных производных с помощью 4-хлормеркурибензоата, 4-хлормеркурифенилсульфоновой кислоты, фенилмеркурихлорида, 2-хлормеркури-4-нитрофенола и других ртутных соединений; карбамоилирование цианатом при щелочных значениях рН.
Триптофановые остатки могут быть модифицированы, например, окислением с помощью N-бромсукцинимида или алкилированием индольного кольца с помощью 2-гидрокси-5-нитробензилбромида или сульфенилгалоидов. Тирозиновые остатки, с другой стороны, могут быть модифицированы нитрованием тетранитрометаном с образованием 3-нитротирозинового производного.
Модификацию имидазольного кольца остатков гистидина можно осуществить алкилированием с производными иодуксусной кислоты или N-карбоэтоксилированием с помощью диэтилпирокарбоната.
Примеры включения искусственных аминокислот и производных в процессе синтеза белка включают, не ограничиваясь этим, использование норлейцина, 4-амино-масляной кислоты, 4-амино-3-гидрокси-5-фенилпентановой кислоты, 6-аминогексановой кислоты, t-бутилглицина, норвалина, фенилглицина, орнитина, саркозина, 4-амино-3-гидрокси-6-метилгептановой кислоты, 2-тиенилаланина и/или D-изомеров аминокислот. Список искусственных аминокислот, предусмотренных настоящим изобретением, приведен в Таблице 1.
Поперечные сшивки могут применяться, к примеру, для стабилизации трехмерной конформации с помощью таких реагентов, как гомобифункциональные перекрестно сшивающие агенты (кросслинкеры) типа бифункциональных имидоэфиров со спейсерными группами (CH2)n от n=1 до n=6, глутаральдегид, эфиры N-гидроксисукцинимида, и гетеробифунциональные реагенты, которые обычно содержат одну группировку типа N-гидроксисукцинимида, реагирующую с аминами, и вторую группировку, реагирующую с другими группами.
Молекулы, которые вводятся млекопитающим в соответствии с настоящим изобретением, могут быть также связаны с веществом для целенаправленной доставки, например, моноклональным антителом, обеспечивающим специфическую доставку этих молекул в клетки-мишени.
Следующий вариант данного изобретения касается применения изобретения в связи с лечением и/или профилактикой заболеваний. Не ограничивая данное изобретение какой-то одной теорией или механизмом действия, авторы изобретения не только установили, что конститутивная активация сфингозинкиназы приводит к трансформации клеток и развитию опухоли, что указывает на то, что сфингозинкиназа сама по себе онкогенна, но также установили и то, что ингибирование сфингозинкиназы эффективно при подавлении пролиферации неопластических клеток, когда эти клетки трансформированы определенными неродственными онкогенами, например, при Ras-индуцированной трансформации. Соответственно, способ настоящего изобретения особенно полезен, но ни в коем случае не ограничивается этим, при лечении первичных и вторичных злокачественных опухолей, таких как твердые опухоли толстой кишки, желудка, легких, мозга, кости, пищевода и поджелудочной железы, и в особенности опухолей, связанных с пролиферацией Ras-трансформированных клеток. Несмотря на то, что предпочтительный способ заключается в подавлении неконтролируемой пролиферации клеток у пациента, в определенных обстоятельствах также может быть желательно и усиление клеточного роста, например, при заживлении ран, ангиогенезе или других процессах заживления.
Соответственно, настоящее изобретение предусматривает способ лечения и/или профилактики заболеваний, характеризующихся ненормальным, нежелательным или иным ненадлежащим ростом клеток у млекопитающих, при этом способ включает введение млекопитающему эффективного количества некоего средства в течение времени и в условиях, достаточных для модуляции функциональной активности сфингозинкиназы, причем подавление функциональной активности сфингозинкиназы ведет к подавлению роста соответствующих клеток, а усиление функциональной активности сфингозинкиназы ведет к усилению роста соответствующих клеток.
"Ненормальный, нежелательный или иным образом ненадлежащий" рост клеток следует понимать как чрезмерно активный рост клеток, как физиологически нормальный рост клеток, который нежелателен, или как недостаточный рост клеток. Предпочтительно ненадлежащий рост клеток означает неконтролируемую пролиферацию клеток.
Согласно предпочтительному варианту предусматривается способ лечения и/или профилактики заболеваний, характеризующихся неконтролируемой пролиферацией клеток у млекопитающих, при этом способ включает введение млекопитающему эффективного количества некоего средства в течение времени и в условиях, достаточных для подавления функциональной активности сфингозинкиназы.
Неконтролируемая пролиферация клеток предпочтительно вызвана их трансформацией вследствие усиления активности онкогена или онкогенного действия суперэкспрессии сфингозинкиназы.
Еще более предпочтительно, когда клетки являются злокачественными клетками, образующими твердую опухоль в толстой кишке, желудке, легком, мозге, кости, пищеводе, поджелудочной железе, молочной железе, яичнике или матке.
Указанное средство предпочтительно представляет собой N,N-диметилсфингозин или DL-трео-дигидросфингозин.
Способ настоящего изобретения предпочтительно способствует уменьшению, замедлению или ингибированию пролиферации клеток. "Уменьшение, замедление или ингибирование" следует понимать как индукцию или облегчение частичного или полного ингибирования пролиферации клеток. Механизмы такого ингибирования могут быть прямыми или косвенными, они включают индукцию клеточного апоптоза или другие механизмы гибели клеток.
Предметом лечения или профилактики обычно являются млекопитающие, такие как человек, приматы, сельскохозяйственные животные (овцы, коровы, лошади, ослы, свиньи), домашние животные (собаки, кошки), лабораторные животные (мыши, кролики, крысы, морские свинки, хомячки), пойманные дикие животные (лисы, олени), однако изобретение не ограничивается ими. Предпочтительно, млекопитающее - это человек или примат. Наиболее предпочтительно - человек. Хотя настоящее изобретение раскрывается на примере мышей или крыс, это не означает, будто его применение ограничивается ими, оно распространяются и на другие виды, в частности, человека.
Другой вариант настоящего изобретения касается лечения и/или профилактики неопластических заболеваний у млекопитающих, при этом способ включает введение млекопитающему эффективного количества средства в течение времени и в условиях, достаточных для подавления функциональной активности сфингозинкиназы.
Предпочтительно неопластическое заболевание представляет собой злокачественную опухоль, а еще более предпочтительно злокачественная опухоль представляет собой твердую опухоль толстой кишки, желудка, легких, мозга, кости, пищевода или поджелудочной железы.
Более предпочтительно злокачественная опухоль вызвана трансформацией клеток вследствие усиления активности онкогена или онкогенного действия суперэкспрессии сфингозинкиназы.
Еще более предпочтительно, когда указанное средство представляет собой N,N-диметилсфингозин или DL-трео-дигидросфингозин.
В настоящем изобретении "лечение" и "профилактику" следует понимать в самом широком смысле. Термин "лечение" не обязательно означает, что подвергающееся лечению млекопитающее достигнет полного выздоровления. Аналогично и "профилактика" не обязательно означает, что пациент со временем не заболеет. Соответственно, лечение и профилактика заключаются в облегчении симптомов определенного заболевания либо предотвращении или уменьшении риска возникновения данного заболевания. Можно считать, что термин "профилактика" означает уменьшение тяжести или приступа данного заболевания. "Лечение" также может уменьшать тяжесть протекания болезни.
Введение средства (сфингозинкиназы или ее функционального эквивалента, производного, гомолога, аналога или миметика, либо молекулы нуклеиновой кислоты сфингозинкиназы) [именуемого в настоящем изобретении "модуляторным средством"] в виде фармацевтической композиции может проводиться любым удобным методом. Предусматривается, что модуляторное средство фармацевтической композиции проявляет терапевтическую активность при введении в дозе, зависящей от конкретного случая. Колебания зависят, например, от человека или животного и выбранного модуляторного средства. Может применяться широкий спектр доз. В зависимости от больного, например, могут применяться дозы от 0,1 мг до 1 мг модуляторного средства на кг веса тела в день. Дозировку можно подбирать таким образом, чтобы обеспечить оптимальный терапевтический эффект. Например, можно вводить разделенную на части дозу ежедневно, еженедельно, ежемесячно или через другие подходящие промежутки времени, а также можно пропорционально снижать дозу в зависимости от ситуации. Модуляторное средство можно вводить любым удобным способом, например перорально, внутривенно (если оно водорастворимо), внутрибрюшинно, внутримышечно, подкожно, внутридермально, в виде свечей или имплантатов (например, с помощью молекул для замедленного выделения). Модуляторное средство можно вводить в виде фармацевтически приемлемых нетоксических солей, к примеру солей, образованных кислотами, или в виде комплекса с металлами, например, с цинком, железом и т.п. (которые в настоящей заявке считаются солями). Примерами солей, образованных кислотами, могут служить хлориды, бромиды, сульфаты, фосфаты, малеаты, ацетаты, цитраты, бензоаты, сукцинаты, малаты, аскорбаты, тартраты и т.д.. Если активный ингредиент вводится в виде таблеток, эти таблетки могут содержать связующее вещество: трагакант, кукурузный крахмал или желатин; дезинтегрирующее вещество типа альгиновой кислоты; и смазывающее вещество типа стеарата магния.
Способы введения включают, не ограничиваясь этим, респираторный, внутритрахеальный, носоглоточный, внутривенный, внутрибрюшинный, подкожный, внутричерепной, интрадермальный, внутримышечный, внутриглазной, подоболочечный, интрацеребральный, интраназальный, путем инфузии, пероральный, ректальный, через капельницу и в виде имплантата.
В другом варианте настоящее изобретение касается применения средства, способного модулировать функциональную активность сфингозинкиназы, при изготовлении медикамента для модулирования роста клеток у млекопитающих, в котором подавление функциональной активности сфингозинкиназы ведет к подавлению роста данных клеток, а усиление функциональной активности сфингозинкиназы ведет к усилению роста данных клеток.
Рост клеток предпочтительно означает пролиферацию. Более предпочтительно пролиферация означает неконтролируемую пролиферацию клеток, которая подавляется.
Неконтролируемая пролиферация клеток предпочтительно вызвана их трансформацией вследствие усиления активности онкогена или онкогенного действия суперэкспрессии сфингозинкиназы.
Более предпочтительно клетки являются злокачественными клетками, образующими твердую опухоль в толстой кишке, желудке, легком, мозге, кости, пищеводе, поджелудочной железе, молочной железе, яичнике или матке.
Следующий вариант касается средств, предназначенных для модуляции функциональной активности сфингозинкиназы, при котором модулирование функциональной активности сфингозинкиназы ведет к модуляции роста клеток.
Предпочтительно функциональная активность подавляется, тем самым подавляя рост клеток.
В другом предпочтительном варианте функциональная активность сфингозинкиназы усиливается, тем самым усиливая рост клеток.
Более предпочтительно рост клеток означает пролиферацию клеток.
Еще более предпочтительно клетки являются неопластическими клетками и пролиферация подавляется.
Пролиферация клеток, предпочтительно вызвана их трансформацией вследствие усиления активности онкогена или онкогенного действия суперэкспрессии сфингозинкиназы.
Более предпочтительно клетки являются злокачественными клетками, образующими твердую опухоль в толстой кишке, желудке, легком, мозге, кости, пищеводе, поджелудочной железе, молочной железе, яичнике или матке.
Следующий вариант настоящего изобретения касается фармацевтической композиции, включающей модуляторное средство, определенное выше, и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей и/или разбавителей. Модуляторные средства именуются активными ингредиентами.
Фармацевтические формы, пригодные для применения в виде инъекций, включают стерильные водные растворы (если они водорастворимы) или дисперсии и стерильные порошки для немедленного приготовления стерильных растворов для инъекций или дисперсий, либо они могут быть в виде крема или других форм для местного применения. Они должны быть стабильными в условиях производства и хранения и должны быть защищены от загрязнения такими микроорганизмами, как бактерии и грибы. Носитель может быть растворителем или средой диспергирования, содержащей, к примеру, воду, этанол, полиоль (например, глицерин, пропиленгликоль или жидкий пропиленгликоль и т.п.), их смеси и растительные масла. Надлежащая текучесть может поддерживаться, к примеру, с помощью покрытия типа лецитина, выдерживанием требуемого размера частиц в случае дисперсии и с помощью поверхностно-активных веществ. Защита от действия микроорганизмов осуществляется с помощью различных антибактериальных и противогрибковых средств, например парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимерозала и т.п. Во многих случаях предпочтительно включать изотонические средства, например сахар или хлористый натрий. Продление всасывания инъецируемой композиции осуществляется применением в композициях веществ, замедляющих всасывание, например моностеарата алюминия и желатина.
Стерильные растворы для инъекций получают введением активных соединений в необходимом количестве в соответствующий растворитель вместе с разными другими ингредиентами, перечисленными выше, по необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием. Обычно дисперсии получают введением различных стерильных активных ингредиентов в стерильный носитель, содержащий основную среду диспергирования и другие необходимые ингредиенты из числа перечисленных выше, В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций предпочтительные способы получения - это высушивание под вакуумом и лиофилизация, в результате чего из предварительно стерилизованного фильтрованием раствора получают порошок из активного ингредиента плюс всех необходимых дополнительных ингредиентов.
Когда активные ингредиенты соответствующим образом защищены, их можно вводить перорально, к примеру, вместе с неактивным растворителем или с усваиваемым съедобным носителем, или их можно заключить в твердую или мягкую желатиновую капсулу, или запрессировать в таблетки, или включить непосредственно в пищевую добавку. При пероральном терапевтическом введении активное соединение может быть включено вместе с наполнителями и применяться в форме таблеток для приема внутрь, таблеток для медленного растворения в щечном кармане, пастилок, капсул, элексиров, суспензий, сиропов, вафель и т.д. Такие композиции и препараты должны содержать не менее 1% по весу активного соединения. Содержание его в композициях и препаратах, конечно, может варьироваться и вполне подходят составы от 5 до 80% от общего веса. В таких композициях для терапевтического применения содержание активного соединения должно быть таким, чтобы получить подходящие дозы. Предпочтительно композиции или препараты по настоящему изобретению готовят в таком виде, чтобы пероральная единица дозы находилась в форме, содержащей от 0,1 мкг до 2000 мкг активного соединения.
Таблетки, пастилки, пилюли, капсулы и т.д. могут также содержать следующие компоненты: связующее вещество типа камеди, гуммиарабика, кукурузного крахмала или желатина; наполнитель типа бифосфата кальция; дезинтегрирующее вещество типа кукурузного крахмала, картофельного крахмала, альгиновой кислоты и т.п.; смазывающее веществ типа стеарата магния; также можно добавлять подслащивающее вещество типа сахарозы, лактозы или сахарина и вкусовые добавки типа мятного масла, винтергринового масла или аромата вишни. Когда лекарственная форма представлена капсулами, она может содержать, наряду с веществами вышеуказанного типа, еще и жидкий носитель. Также могут присутствовать и различные другие материалы: покрытия или другие модификаторы физической формы. Например, таблетки, пилюли или капсулы могут быть покрыты шеллаком, сахаром или тем и другим. Сиропы и эликсиры могут содержать активное соединение, сахарозу как подслащивающее вещество, метил- и пропилпарабен в качестве консервантов, краситель и вкусовую добавку, например аромат вишни или апельсина. Конечно, все материалы, используемые при изготовлении лекарственных форм, должны быть фармацевтически чистыми и практически нетоксичными в применяемых количествах. Кроме того, активное соединение (соединения) может быть включено в препараты и составы пролонгированного действия.
Фармацевтическая композиция может также содержать генетические молекулы, такие как вектор, способный трансфецировать клетки-мишени и несущий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей модуляторное средство. Вектор может быть, к примеру, вирусным вектором.
Скринирование модуляторных средств, определенных выше, может проводиться любым из нескольких подходящих способов, известных специалистам в этой области, включая, но ни в коем случае не ограничиваясь этим, обработку средством клеток, содержащих ген сфингозинкиназы либо ее функциональный эквивалент или производное, и скринирование на предмет модуляции образования белкового продукта или функциональной активности сфингозинкиназы, модуляции экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей сфингозинкиназу, или модуляции активности или экспрессии дальнейшей клеточной мишени сфингозинкиназы. Обнаружение такой модуляции может осуществляться такими методами, как Westem-гибридизация, анализ сдвига электрофоретической подвижности и/или определение репортеров активности сфингозинкиназы.
Следует иметь в виду, что ген сфингозинкиназы или ее функционального эквивалента или производного может естественным образом находиться в исследуемой клетке или может быть трансфецирован в клетку хозяина для исследования. Далее, естественно находящийся или трансфецированный ген может экспрессироваться конститутивно - и тем самым служить моделью, пригодной, между прочим, для скринирования веществ, подавляющих активность сфингозинкиназы как на уровне нуклеиновой кислоты, так и на уровне продукта экспрессии, либо же ген может требовать активации - и тем самым служить моделью, пригодной, между прочим, для скринирования веществ, усиливающих экспрессию сфингозинкиназы. Далее, в случае, когда молекула нуклеиновой кислоты сфингозинкиназы трансфецирована в клетку, такая молекула может представлять полный ген сфингозинкиназы или может содержать только часть гена, например ту, которая регулирует экспрессию продукта сфингозинкиназы. Например, в исследуемую клетку можно трансфецировать область промотора сфингозинкиназы. При этом, если используется только промотор, обнаружение модуляции активности промотора может осуществляться, к примеру, посредством лигирования промотора с геном-репортером. Например, промотор может быть лигирован с люциферазой или САТ-репортером, а модуляцию экспрессии данного гена можно обнаружить по модуляции интенсивности флуоресценции или активности САТ-репортера, соответственно.
В другом случае предметом детекции может быть не сама сфингозинкиназа, а ее регуляторная мишень. При этом детекция может осуществляться такими методами, как микроматрицы (например, chip arrays, nylon arrays), SAGE-анализ, RDA или дифференциальный дисплей.
Такие методы обеспечивают высокопроизводительное скринирование вероятных модуляторных средств, белковых или небелковых, из искусственных, рекомбинантных, химических и естественных библиотек. Эти методы также облегчают детекцию веществ, связывающих молекулы нуклеиновой кислоты сфингозинкиназы или ее продукты экспрессии, или модуляторов экспрессии предшествующей молекулы, которая затем модулирует экспрессию сфингозинкиназы или активность продукта экспрессии. Соответственно, эти методы обеспечивают механизм обнаружения веществ, прямо или косвенно модулирующих экспрессию сфингозинкиназы и/или ее активность.
Как изложено выше, под "сфингозинкиназой" следует понимать либо продукт экспрессии сфингозинкиназы, либо молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей сфингозинкиназу. Под этим также следует понимать и фрагмент молекулы сфингозинкиназы, например, регуляторный участок молекулы нуклеиновой кислоты сфингозинкиназы. Альтернативно, молекула может содержать область связывания или активного участка продукта экспрессии. В этом случае молекула нуклеиновой кислоты сфингозинкиназы и/или экспрессируемый продукт экспрессируется в клетке. Клетка может быть клеткой хозяина, которая трансфецирована молекулой нуклеиновой кислоты сфингозинкиназы, или она может быть клеткой, которая естественным образом содержит ген сфингозинкиназы.
Метод скринирования, определенный в настоящем изобретении, может основываться на детекции "изменений экспрессионного фенотипа, связанного со сфингозинкиназой". Это следует понимать как выявление изменений в состоянии клеток или культуры клеток, связанных с модуляцией активности сфингозинкиназы. Они могут проявляться, например, как внутриклеточные изменения или изменения, наблюдаемые извне. Например, к ним относятся (не ограничиваясь этим) изменения уровня экспрессии продукта, изменения в состоянии культуры клеток или, в том случае, когда регуляторная область сфингозинкиназы пришита к молекуле-репортеру типа люциферазы или CAT, определение изменений в экспрессии молекулы репортера. С другой стороны, такая система скринирования может быть основана на выявлении изменений в экспрессии следующих за сфингозинкиназой молекул, которые регулируются продуктом экспрессии сфингозинкиназы.
Следующий вариант настоящего изобретения касается модуляторных средств, определенных ранее, когда они применяются в способе настоящего изобретения.
Следующий вариант настоящего изобретения касается методов диагностики, основанных на скринировании лиц на присутствие сфингозинкиназы, либо мРНК, белка, или специфических форм сфингозинкиназы, транскрибируемых и/или транслируемых в данной популяции клеток. Методология скринирования может быть направлена на качественный и/или количественный анализ сфингозинкиназы. Это особенно полезно, например, при определении того, предрасположено или устойчиво данное лицо к заболеваниям, при которых ненормальный, нежелательный или иным образом ненадлежащий рост клеток является составной частью заболевания, и/или того, предрасположено или устойчиво оно к возникновению определенных форм ненормального, нежелательного или иным образом ненадлежащего роста клеток. Подобное скринирование можно провести, используя методы, хорошо известные специалистам в этой области, включая, но не ограничиваясь этим:
(i) Анализ содержания сфингозинкиназы для скринирования на предмет изменения активности или уровня сфингозинкиназы. Скринирование по этим параметрам может проводиться в биологических жидкостях или тканях организма. Хотя сфингозинкиназа обычно не секретируется, зато секретируется ее последующий продукт - сфингозин-1-фосфат. Модуляция уровня этой молекулы, таким образом, может служить индикатором изменений уровня или активности сфингозинкиназы. Тем не менее, не следует исключать и скринирование по внеклеточной сфингозинкиназе.
(ii) Анализ сфингозинкиназы на возможные мутации/полиморфизм (SNPs) и мутации может проводиться по анализу кривой плавления ДНК, полученной методом ПЦР с помощью системы LightCycler (Roche).
(iii) Скринирование сфингозинкиназы на полиморфизм с помощью микроматриц ДНК Chip Arrays (например, картирование SNPs с помощью Affimetrix GeneChip или технологии Incyte technology platform fSSCP для обнаружения SNP).
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Далее настоящее изобретение раскрывается на нижеследующих примерах, не ограничиваясь ими.
ПРИМЕР 1
Трансфекция и анализ фибробластов NIH 3Т3
Для исследования онкогенной роли SphK (сфингозинкиназы) нетрансформированные фибробласты NIH 3Т3 были трансфецированы кДНК SphK, которая недавно была клонирована в нашей лаборатории (Piston et al., 2000). Во избежание фенотипических артефактов, могущих возникать вследствие отбора и размножения индвидуальных клонов от единичных трансфецированных клеток, использовали объединенные образцы (пулы) стабильных трансфектантов (обозначаемых как SK-3T3). В пулах клеток SK-3T3 активность SphK была увеличена в 600 раз (Фиг.1а) по сравнению с трансфецированными исходным вектором клетками NIH 3Т3 (N-3T3). Анализ методом иммуногибридизации выявил специфическую полосу белка, молекулярный вес которого явно соответствует предсказанному размеру SphK человека с FLAG-меткой, которая выявлялась только в пулах клеток SK-3T3, но отсутствовала в клетках N-3T3 (Фиг.1с). Внутриклеточный уровень S1P (сфингозин-1-фосфата), прямого продукта SphK, также был увеличен в клетках SK-3T3 в 4-5 раз, что указывает на то, что они являются стабильными трансфектантами с конститутивной активацией SphK (Фиг.1b). Уровень S1P не был прямо пропорциональным увеличению активности SphK, измеренной in vitro, видимо, вследствие быстрой деградации S1P S1P-фосфатазой и S1P-лиазой и ограниченного наличия сфингозина в качестве субстрата для образования S1P.
Кривые роста отражали значительное отличие между пулами клеток SK-3T3 и контрольными клетками (Фиг.2а). Стабильная экспрессия SphK значительно усиливала рост клеток в среде, содержащей 1% или 10% сыворотки. Даже в бессывороточной среде клетки SK-3T3 выживали и росли в течение 7 дней, в то время как клетки N-3T3 погибали. Более того, когда клетки достигали насыщающей плотности, клетки SK-3T3 продолжали пролиферировать (Фиг.2b), наводя на мысль о том, что они избежали контактного ингибирования. Обработка клеток SK-3T3 специфическим ингибитором SphK - N,N-диметилсфингозином (DMS) значительно снижала усиление пролиферации, вызванное суперэкспрессией SphK, тогда как DMS не влиял на пролиферацию клеток N-3T3 (Фиг.2с). Эти результаты указывают на то, что конститутивная активация SphK в стабильно трансфецированных SphK клетках подавляет два ключевых параметра лимитированного роста: зависимость от сыворотки и контактное ингибирование.
Оценка трансформирующей активности в клетках NIH 3Т3 по образованию очагов показала, что клетки, трансфецированные SphK, но не исходным вектором, индуцировали образование многочисленных очагов (Табл.1 и Фиг.3а). Как SphK, так и контрольные векторы обладали близкой эффективностью в образовании G418-резистентных колоний, указывая на то, что трансформирующая активность не является следствием неспецифического влияния трансфекции. Более того, клетки SK 3Т образовывали большие колонии на мягком агаре (Табл.2 и Фиг.3b), показывая, что они обладают независимым от прикрепления к субстрату ростом. Хотя клетки N-3T3 и обладали фоновой способностью к образованию колоний, видимо, вследствие спонтанной трансформации, однако суперэкспрессия SphK приводила к 20-50-кратному возрастанию числа колоний и заметному увеличению размера колоний (Табл.2). Важно, что DMS ингибировал трансформирующую способность SphK дозовозависимым образом, причем 2,5 мкМ DMS вызывал полное возвращение к нормальному фенотипу (Фиг.3b). Это означает, что трансформирующая способность этого фермента обусловлена повышением активности SphK, а не простым усилением экспрессии SphK.
ПРИМЕР 2
Трансфекция и анализ клеток, трансформированных онкогеном
При трансфекции клеток NIH 3Т активированным мутантным Ras (V12-Ras) активность SphK значительно повышалась на 178±22% по сравнению с исходными клетками (Фиг.3с). Напротив, при трансфекции клеток v-Src (Фиг.3с) или доминантнонегативным Ras (N17-Ras) увеличения активности SphK не наблюдалось, что предполагает специфическое участие SphK в трансформации некоторыми онкогенами. Более того, когда клетки обрабатывали DMS, образование очагов снижалось на 42±4% в клетках, трансформированных V-Ras, но не было изменений в клетках, трансформированных v-Src (Фиг.3d), что указывает на важную роль SphK в Ras-трансформации. Частичный эффект DMS при 2,5 мкМ, который был полностью эффективным в SphK-трансформированных клетках (Фиг.3b), указывает на возможное наличие других путей, независимых от SphK. С другой стороны, неспособность DMS ингибировать v-Src-трансформацию исключает неспецифическое влияние DMS или общую токсичность в результате ингибирования SphK. Таким образом, повышение активности SphK оказывает трансформирующее действие не только собственно из-за усиления экспрессии, оно также играет роль в трансформации онкогенами, например, индуцированной Ras.
ПРИМЕР 3
Анализ онкогенности
Затем исследовали онкогенность непосредственно на клетках NIH 3Т3 с усиленной экспрессией SphK. Когда SphK-трансфецированные клетки NIH 3Т из пулов стабильных трансфектантов или отобранных клонов вводили подкожно мышам линии NOD/SCID, через 3-4 недели в месте инъекции наблюдались опухоли (Табл. 4 и Фиг.4). Ни у одной из мышей, которым инъецировали трансфецированные холостым вектором клетки 3Т3, не наблюдалось появления опухолей за 10 недель наблюдения. Гистологический анализ срезов опухолей показал наличие морфологии остеосаркомы с множеством митотических веретен (Фиг.4). Westem-гибридизация экстрактов, полученных из опухолей, выявила высокое содержание белка с FLAG-меткой (Фиг.4), показывая, что неопластические клетки удерживают и экспрессируют трансгены SphK. Таким образом, опухоли развивались из введенных SphK-трансфецированных клеток, но не из спонтанно трансформированных клеток NIH 3Т3. Это является первой демонстрацией того, что ген липиднкиназы дикого типа - SphK человека - действует как онкоген, обеспечивая потенциальную связь между этим ферментом и патогенезом опухолей у млекопитающих. Таким образом, наши данные расширяют понимание фосфолипидов, в частности сфинголипидов, как передатчиков сигналов, регулирующих клеточный рост, трансформацию и онкогенез.
ПРИМЕР 4
Материалы и методы
(а) Трансфекция сфингозинкиназы
Фибробласты NIH 3Т3 были получены из American Type Culture Collection и поддерживались в среде DMEM (Gibco BRL) с добавлением 10% телячьей сыворотки. кДНК SphK человека с FLAG-меткой субклонировали в плазмиду pcDNA3 (Invitrogen Corp.), как описано ранее (Pitson et al., 2000). Для временных трансфекций 5 мкг плазмид трансфецировали в 5×105 клеток с помощью Lipofectamine Plus (Gibco BRL) согласно методике производителя. Для стабильной экспрессии применяли метод осаждения фосфатом кальция и трансфектантов отбирали в среде, содержащей 500 мкг/мл G418 (Gibco BRL). Во избежание клональной вариабельности отбирали неклональные пулы трансфецированных клеток, устойчивых к G418. В некоторых опытах использовали отобранные клоны стабильных трансфектантов.
(b) Измерение активности сфингозинкиназы
Активность SphK измеряли инкубированием цитозольной фракции в присутствии 10 мкМ сфингозина, растворенного в 10% Тритоне Х-100, и [γ32P]АТФ (1 мМ, 0,5 мКи/мл) в течение 15 минут при 37°С, как описано ранее (Xia et al., 1999). Для оценки внутриклеточного содержания S1P клетки метили [Н3]-сфингозином (1 мкМ, 2 мКи/мл) в течение 30 минут и экстрагировали включенную в клеточные липиды радиоактивную метку. Затем разгоняли [3H]-S1P методом тонкослойной хроматографии в смеси 1-бутанол/метанол/ уксусная кислота/вода (8:2:1:2, об/об), проявляли и количественно определяли на приборе Phosphoimager®.
(c) Культивирование клеток 3Т3 со сфингозинкиназой
Стабильно трансфецированные клетки NIH 3Т засевали в 48-луночные планшеты (по 1,000 клеток на лунку) в среде DMEM, содержащей 10% телячей сыворотки. Через 8 ч клетки дважды отмывали средой DMEM, а затем выращивали в DMEM, содержащей 1% или 10% сыворотки, а также в бессывороточной среде (DMEM, содержащей 0,1% BSA). Через указанные промежутки времени клетки инкубировали в присутствии 1 мг/мл МТТ в течение 4 часов. Образовавшийся формазан солюбилизировали 10% раствором SDS в 10 мМ HCl и измеряли спектрофотометрически по поглощению при 570 нм и 650 нм. В некоторых опытах клетки трипсинизировали и подсчитывали в гемоцитометре.
(d) Анализ образования очагов
Для оценки образования очагов клетки NIH 3Т3 после нескольких пассажей трансфецировали активированным V12-Ras, v-Src (предоставлены Dr. Julian Downward), SphK или холостым вектором, соответственно, с помощью Lipofectamine Plus, как описано выше в пункте (а). Через 2 дня трансфецированные клетки раздели на порции и засевали в 6-луночные планшеты. После достижения конфлюэнтности их держали в течение 2 недель в среде DMEM, содержащей 5% телячьей сыворотки. Очаги выявляли после окрашивания кристаллическим фиолетовым и подсчитывали. Для анализа на мягком агаре суспензии 1×104 клеток из пулов стабильных трансфектантов в среде, содержащей 0,33% агара, наслаивали на 0,6% агар в отсутствие и в присутствии DMS в различных концентрациях. После инкубации 14 дней окрашивали колонии с помощью 0,1 мг/мл МТТ и те из них, что были диаметром свыше 0,1 мм, считали положительными при подсчете.
(e) Индукция опухолей
Мышей NOD/SCID разводили и содержали в стерильных условиях. Мышам в возрасте от 4 до 6 недель вводили подкожно 5×105 клеток из различных клеточных линий (пулов стабильных, трансфецированных SphK или холостым вектором клеток NIH 3Т3, и двух колоний SphK-трансфектантов) в 200 мкл стерильного фосфатно-солевого буфера. Каждую линию клеток тестировали на 3 различных животных.
Специалисты в этой области понимают, что описанное нами изобретение можно подвергать не только тем вариациям и модификациям, которые описаны нами. Следует иметь в виду, что изобретение включает все такие вариации и модификации. Изобретение также включает все стадии, характеристики, композиции и соединения, упомянутые или указанные в настоящей спецификации, по отдельности или вместе, а также любые комбинации из любых двух или нескольких указанных стадий или характеристик.
Оценка трансформации в трансфецированных клетках NIH 3Т3
Определяли образование очагов в клетках NIH 3Т3, временно трансфецированных SphK (SK-3T3) или исходным вектором (N-3T3). Трансфецированные клетки засевали в 6-луночные планшеты и культивировали 2-3 недели, а затем окрашивали кристаллическим фиолетовым. Образование колоний на мягком агаре определяли в стабильно трансфецированных клетках. Представлены средние значения ±SD из 3-5 опытов по двум или трем измерениям.
Онкогенез у мышей NOD/SCID
1,9×1,5×1,0
1,1×0,9×0,8
2,85
0,79
1,6×1,2×0,5
2,5×1,6×1,3
0,96
5,20
2,2×1,5×1,1
1,8×1,7×0,9
3,63
2,75
Мышам NOD/SCID инъецировали клетки (5×105 клеток на мышь) из пула клеток NIH 3Т3, трансфецированных холостьм вектором или SphK. (N-3T3 или SK-3T3), либо из двух отдельных SphK-трансфецированных клонов (КТ-2 и КТ-5). Размер опухолей определяли через 4 недели после инъекции.
Источники информации
1. Allessenko, A.V. (1998) Biochemistry (Mosc) 63: 62-68.
2. Culliver, О., Pirianov, G., Kleuser, В., Vanek, P.O., Coso, O.A., Gutkind, J.S. and Spiegel, S. (1996) Nature 381: 800-803.
3. Igarashi, Y. (1997) J. Biochem. 122: 1080-1087.
4. Meyer zu Heringdorf, D., van Koppen, C.L. and Jacobs, K.H. (1997) FEBS Lett. 410:34-38.
5. Pitson, S.M. et al. (2000) Biochem. J., submitted.
6. Spiegel, S., Culliver, О., Edsall, L., Kohama, Т., Menzeleev, R., Olivera, A., Thomas, D., Tu, Z., Van Brocklyn, J. and Wang, F. (1998) Biochemistry (Mosc) 63: 69-73.
7. Xia, P., Gamble, J.R., Rye, К.-A., Wang, L., Hii, C.S.T., Cockerill, P., Khew-Goodall, Y., Bert, A.G., Barter, P.J., and Vadas, M.A. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 14196-14201.
8. Xia, P., Vadas, M.A, Rye, K.-A., Barter, P.J., Gamble, J.R. (1999) J. Biol. Chem. 274: 33143-33147.
Изобретение относится к области медицины и касается способа модулирования роста клеток и, более точно, способа подавления роста неопластических клеток. Сущность изобретения включает способ понижающей регуляции (подавления) пролиферации неопластических клеток, которые были трансформированы в результате активации онкогена, эффективным количеством средства для подавления функциональной активности сфингозинкиназы и повышающей регуляции (активации) пролиферации этих клеток обработкой их средством для повышающей активации онкогенной активности сфингозинкиназы. Изобретение также касается способа диагностики неоплазии. Преимущество изобретения заключается в обнаружении нового маркера онкогенности, а именно факта онкогенной активности сфингозинкиназы. 6 н. и 33 з.п. ф-лы, 3 табл., 4 ил.
| Прибор, замыкающий сигнальную цепь при повышении температуры | 1918 |
|
SU99A1 |
| WO 00/00207 A, 08.01.2000 | |||
| HAUSER et al., Role of ceramide in mitogenesis indused by exogenous spingoid basy, J | |||
| Biol | |||
| Chem., 1994, v.269, pp.6803-6809. | |||
