СПОСОБ ОПТИМАЛЬНОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ НАИБОЛЕЕ ЧАСТО ВСТРЕЧАЮЩИХСЯ ЦИТРАТ-АССИМИЛИРУЮЩИХ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ, ИМЕЮЩИХ МЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ Российский патент 2018 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Изобретение относится к области медицины и может найти применение в медицинской микробиологии при идентификации цитрат-ассимилирующих энтеробактерий, изолированных при микробиологической диагностике дисбиотических состояний кишечника (дисбактериозов) у детей и взрослых, а также заболеваний; обусловленных этими энтеробактериями.

К цитрат-ассимилирующим бактериям семейства Enterobacte cloasae относятся представители различных родов и видов, обладающие способностью использовать цитрат натрия как единственный источник углерода. При посеве такого микроорганизма на питательную среду, содержащую цитрат натрия (среду Симмонса), в ходе реакции происходит сдвиг pН в щелочную сторону, в результате чего среда окрашивается в ярко-синий цвет (исходная среда имеет зеленую окраску).

К наиболее часто встречаемым в медицинской практике цитрат-ассимилирующим энтеробактериям относятся: род Клебсиелла -K.pneumoniae (с подвидами пневмонии, озены и риносклероматис), K.oxytoca; род Цитробактер - C.amalonaticus, C.freundii, C.koseri, C.youngae; род Энтеробактер - E.aerogenes, Е.cloacae; род Серрация - S.marcescens, S.plymuthica, S.rubidaea; род Провиденция; род Протеус - P.vulgaris, P.mirabilis.

Эти микроорганизмы являются условно-патогенными. Они в незначительных количествах могут находиться в толстом отделе кишечника человека, составляя его так называемую «нормальную» микрофлору. При дисбиотических нарушениях кишечника (дисбактериозе) количество условно-патогенной микрофлоры и в том числе цитрат-ассимилирующих бактерий может значительно увеличиться и превысить возрастную норму, что выявляется при целенаправленной микробиологической диагностике и требует соответствующего лечения. Кроме того, нельзя не учитывать и факт значительного увеличения изоляции при дисбактериозах кишечника многокомпонентных микробных ассоциаций, в состав которых, как правило, входят цитрат-ассимилирующие бактерии, а также возможности этих микроорганизмов вызывать инфекционные заболевания с кишечной и внекишечной локализацией.

Идентификации как таковой группы цитрат-ассимилирующих бактерий, дающих возможность определить не только род, но и вид, а иногда и подвид, используя при этом ограниченный набор тестов, в доступной нам литературе не встретилось.

Наибольшую популярность в последние годы приобрели автоматические бактериологические анализаторы для микрообъемной идентификации, в том числе энтеробактерий. В нашей стране широкое распространение получил метод идентификации бактерий с помощью баканализатора Vitek-2 Compact (производства фирмы Bio Merieux, Франция). Подобной техникой оснащены крупные лаборатории и медицинские центры. Такого типа баканализаторы позволяют быстро, без значительных физических затрат и при этом с большой точностью идентифицировать значительное число известных микроорганизмов. Однако большим недостатком идентификации микроорганизмов с помощью этого баканализатора является высокая стоимость как самой аппаратуры, так и расходных материалов к ней, что делает невозможным исследование большого объема материала; кроме того, такая аппаратура едва ли доступна для маленьких лабораторий или других небольших медучреждений. При использовании подобных анализаторов для идентификации цитрат-ассимилирующих энтеробактерий происходит необоснованный расход тест-систем, так как для каждого штамма микроорганизма аппарат использует 64 диагностических теста, тогда как цитрат-ассимилирующие бактерии не требуют такого количества, а могут быть определены с помощью гораздо меньшего набора, что позволяет значительно удешевить их идентификацию, сохранив при этом достаточно высокую точность.

Известен ряд методов идентификации энтеробактерий, число и эффективность которых из года в год повышается. Наиболее востребованными и достаточно точными являются макро- и микрообъемные методы биохимической идентификации (использование СИБов - системы индикаторных бумажных, ПБДЭ - пластин биохимических, диагностирующих энтеробактерий - обе системы производства «Микроген», г. Нижний Новгород). Однако обе эти системы не лишены недостатков, так, для системы ПБДЭ необходимо наличие большого числа (20) лунок с субстратами и требуется использование таких тестов, которые при идентификации цитрат-ассимилирующих бактерий могут быть опущены или заменены другими. Кроме того, при использовании этой системы нередко бывают затруднения при учете результатов в связи с недостаточным размером лунки, что сказывается как на точности посева, так и учета результатов.

Наиболее близким способом к заявляемому является способ использования СИБов, дающий возможность провести идентификацию с помощью 13 тестов, но он неудобен технически, требует значительных затрат рабочего времени, лабораторной посуды с предварительным ее мытьем, заготовкой, стерилизацией и некоторыми другими манипуляциями, что также увеличивает время выполнения исследования, трудозатраты и в конечном итоге его стоимость. Кроме того, способ с использованием СИБов обладает низкой глубиной идентификации: он предназначен только для межродовой и межвидовой идентификации и не способен определить подвид микроорганизма.

Техническим результатом заявленного решения является увеличение глубины идентификации путем определения рода, вида и подвида цитрат-ассимилирующих энтеробактерий.

Технический результат достигается тем, что в способе оптимальной идентификации наиболее часто встречающихся цитрат-ассимилирующих энтеробактерий, имеющих медицинское значение, включающем пересев изучаемой колонии микроорганизмов, выросших на среде Эндо или Симмонса, пересев для первичной и последующей идентификации производится с использованием ограниченного набора тестов: индолообразования, продукции сероводорода, подвижности и утилизации цитрата натрия, по характеру изменения которых изучаемые микроорганизмы в начале подразделяются на шесть условных групп, а в дальнейшем, в зависимости от принадлежности к определенной группе, используются основной и при необходимости дополнительный для каждой группы тест, а именно лизин и при необходимости мочевина - для I группы, включающей неподвижные бактерии, не продуцирующие индол и сероводород и ассимилирующие цитрат натрия при росте на среде Симмонса: Klebsiella pneumoniae с подвидами: ssp.pneumoniae, ssp.ozenae, ssp.rhinoscleromatis; лизин и при необходимости последовательно сорбит, аргинин и рамноза - для III группы, включающей подвижные бактерии, не продуцирующие индол и сероводород и ассимилирующие цитрат натрия: Enterobacter cloacae ssp.cloacae, Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens, Serratia plymuthica и Serratia rubidaea; фенилаланин, а в дальнейшем малонат натрия - для IV группы, включающей подвижные штаммы, продуцирующие индол и не продуцирующие сероводород, а также ассимилирующие цитрат натрия: Citrobacter amalonaticus, Citrobacter koseri, а также бактерии рода Providencia; фенилаланин и в дальнейшем лактоза - для VI группы, включающей бактерии подвижные, не продуцирующие индол и продуцирующие сероводород, в большинстве ассимилирующие цитрат натрия: Proteus mirabilis, Citrobacter freundii, Citrobacter youngae; бактерии II и V группы идентифицируются только по первичным тестам и включают неподвижные штаммы, продуцирующие индол, не продуцирующие сероводород и ассимилирующие цитрат натрия: Klebsiella oxytoca (II группа), а также подвижные штаммы, продуцирующие индол и сероводород и в большинстве ассимилирующие цитрат натрия: Proteus vulgaris (V группа).

Способ оптимальной идентификации наиболее часто встречающихся цитрат-ассимилирующих энтеробактерий, имеющих медицинское значение, осуществляют следующим образом.

Чистую культуру изучаемого микроорганизма, выросшую на чашечных средах Эндо или Симмонса, засевают на мясо-пептонный бульон (для определения продукции индола и сероводорода), на 0,3% мясо-пептонный агар (для определения подвижности) и на пробирочную среду Симмонса (для определения утилизации цитрата натрия). В том случае, если изучаемый штамм изолирован со среды Симмонса, посев на эту среду в пробирке не делается. После инкубации посевов в термостате при 37°С в течение 18-20 час производят учет результатов; при этом идентифицируемые микроорганизмы в зависимости от изменения указанных субстратов могут быть отнесены к одной из шести групп.

К I группе относятся неподвижные бактерии, не продуцирующие индол и сероводород и ассимилирующие цитрат натрия при росте на среде Симмонса - Klebsiella pneumoniae с подвидами (ssp.pneumoniae, ssp.ozenae, ssp.rhinoscleromatis), основным тестом для дифференциации которых является лизин, а дополнительным - мочевина.

Ко II группе относятся неподвижные бактерии, продуцирующие индол, не продуцирующие сероводород и ассимилирующие цитрат натрия; в эту группу входит только единственный вид - Klebsiella oxytoca, который окончательно дифференцируется уже по первичным тестам.

III группа включает подвижные бактерии, не продуцирующие индол и сероводород и ассимилирующие цитрат натрия - Enterobacter cloacae ssp.cloacae, Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens, Serratia plymuthica и Serratia rubidaea, основной дифференцирующий тест группы - лизин, дополнительные тесты - сорбит и аргинин и при необходимости дальнейшей идентификации - рамноза.

IV группа включает подвижные штаммы, продуцирующие индол и не прдуцирующие сероводород, а также ассимилирующие цитрат натрия - Citrobacter amalonaticus, Citrobacter koseri, а также бактерии рода Providencia. Основной дифференцирующий тест группы - фенилаланин, дополнительный - малонат натрия.

V группа объединяет подвижные штаммы, продуцирующие индол и сероводород и ассимилирующие цитрат натрия; сюда, как и во II группу, относится единственный вид - Proteus vulgaris, который дифференцируется по первичным четырем тестам (отдельные штаммы этого микроорганизма могут не утилизировать цитрат натрия).

Роды и виды бактерий, составляющие VI группу, подвижны, не продуцируют индол и продуцируют сероводород, в большинстве утилизируют цитрат натрия - Proteus mirabilis, Citrobacter freundii, Citrobacter youngae. Основной дифференцирующий тест группы - фенилаланин, дополнительный - лактоза. Кроме того, осуществление заявляемого способа представлено в табличной форме (см. приложение).

Для сравнения основных параметров предлагаемого способа было произведено параллельное изучение одних и тех же штаммов цитрат-ассимилирующих энтеробактерий с использованием трех способов: с помощью индикаторных дисков (СИБ) производства «Микроген», Нижний Новгород, баканализатора Vitek-2 Compact 30 производства фирмы «Bio Merieux, Франция, и предлагаемого способа. Результаты отражены в таблице 1.

Результаты, полученные при этом, свидетельствуют о высокой точности предлагаемого способа, практически не уступающей способам сравнения. Кроме того, предлагаемый способ дает возможность идентифицировать большинство микроорганизмов не только до рода и вида, но и до подвида так же, как при использовании высокоточного способа с использованием баканализатора Vitek-2 Compact 30, тогда как способ с использованием СИБов идентифицирует только до рода и вида. Количество используемых тестов значительно меньше у предлагаемого способа, чем у способов сравнения. Стоимость исследования одного микроорганизма у предлагаемого способа в 1,5 раза меньше, чем при применении СИБов, и в 5,4 раза ниже, чем при использовании баканализатора Vitek-2 Compact 30. Кроме того, предлагаемый способ поможет проводить идентификацию цитрат-ассимилирующих штаммов энтеробактерий без использования импортной техники и расходных материалов, что является своего рода средством импортозамещения.

В течение 2015-2016 годов с помощью предлагаемого метода нами было идентифицировано 250 штаммов цитрат-ассимилирующих энтеробактерий, изолированных от лиц с дисбиотическими нарушениями кишечника

Способ оптимальной идентификации наиболее часто встречающихся цитрат-ассимилирующих энтеробактерий, имеющих медицинское значение, позволяющее увеличить глубину идентификации путем определения рода, вида и подвида цитрат-ассимилирующих энтеробактерий, найдет применение в микробиологической диагностике.

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Проводится идентификациия цитрат-ассимилирующих энтеробактерий, изолированных при микробиологической диагностике дисбиотических состояний кишечника (дисбактериозов) у детей и взрослых. Способ включает пересев изучаемой колонии микроорганизмов, выросших на среде Эндо или Симмонса, пересев для первичной и последующей идентификации производится с использованием тестов: индолообразования, продукции сероводорода, подвижности и утилизации цитрата натрия. По характеру изменения изучаемые микроорганизмы в начале подразделяются на шесть условных групп. В дальнейшем в зависимости от принадлежности к определенной группе используются основной и при необходимости дополнительный для каждой группы тест, а именно: лизин и при необходимости мочевина - для I группы, включающей неподвижные бактерии, не продуцирующие индол и сероводород и ассимилирующие цитрат натрия при росте на среде Симмонса: Klebsiella pneumoniae с подвидами: ssp.pneumoniae, ssp.ozenae, ssp.rhinoscleromatis. Лизин и при необходимости последовательно сорбит, аргинин и рамноза - для III группы, включающей подвижные бактерии, не продуцирующие индол и сероводород и ассимилирующие цитрат натрия: Enterobacter cloacae ssp.cloacae, Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens, Serratia plymuthica и Serratia rubidaea. Фенилаланин, а в дальнейшем малонат натрия - для IV группы, включающей подвижные штаммы, продуцирующие индол и не продуцирующие сероводород, а также ассимилирующие цитрат натрия: Citrobacter amalonaticus, Citrobacter koseri, а также бактерии рода Providencia. Фенилаланин и в дальнейшем лактоза - для VI группы, включающей бактерии подвижные, не продуцирующие индол и продуцирующие сероводород, в большинстве ассимилирующие цитрат натрия: Proteus mirabilis, Citrobacter freundii, Citrobacter youngae. Бактерии II и V группы идентифицируются только по первичным тестам и включают неподвижные штаммы, продуцирующие индол, не продуцирующие сероводород и ассимилирующие цитрат натрия: Klebsiella oxytoca (II группа), а также подвижные штаммы, продуцирующие индол и сероводород и в большинстве ассимилирующие цитрат натрия: Proteus vulgaris (V группа). Изобретение позволяет увеличить идентификацию путем определения рода, вида и подвида цитрат-ассимилирующих энтеробактерий. 1 табл.

Способ оптимальной идентификации наиболее часто встречающихся цитрат-ассимилирующих энтеробактерий, имеющих медицинское значение, включающий пересев изучаемой колонии микроорганизмов, выросших на среде Эндо или Симмонса, отличающийся тем, что пересев для первичной и последующей идентификации производится с использованием ограниченного набора тестов: индолообразования, продукции сероводорода, подвижности и утилизации цитрата натрия, по характеру изменения которых изучаемые микроорганизмы в начале подразделяются на шесть условных групп, а в дальнейшем, в зависимости от принадлежности к определенной группе, используются основной и при необходимости дополнительный для каждой группы тест, а именно лизин и при необходимости мочевина - для I группы, включающей неподвижные бактерии, не продуцирующие индол и сероводород и ассимилирующие цитрат натрия при росте на среде Симмонса: Klebsiella pneumoniae с подвидами: ssp. pneumoniae, ssp. ozenae, ssp. rhinoscleromatis; лизин и при необходимости последовательно сорбит, аргинин и рамноза - для III группы, включающей подвижные бактерии, не продуцирующие индол и сероводород и ассимилирующие цитрат натрия: Enterobacter cloacae ssp. cloacae, Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens, Serratia plymuthica и Serratia rabidaea; фенилаланин, а в дальнейшем малонат натрия - для IV группы, включающей подвижные штаммы, продуцирующие индол и не продуцирующие сероводород, а также ассимилирующие цитрат натрия: Citrobacter amalonaticus, Citrobacter koseri, а также бактерии рода Providencia; фенилаланин и в дальнейшем лактоза - для VI группы, включающей бактерии подвижные, не продуцирующие индол и продуцирующие сероводород, в большинстве ассимилирующие цитрат натрия: Proteus mirabilis, Citrobacter freundii, Citrobacter youngae; бактерии II и V группы идентифицируются только по первичным тестам и включают неподвижные штаммы, продуцирующие индол, не продуцирующие сероводород и ассимилирующие цитрат натрия: Klebsiella oxytoca (II группа), а также подвижные штаммы, продуцирующие индол и сероводород и в большинстве ассимилирующие цитрат натрия: Proteus vulgaris (V группа).