Способ получения 2,5-дикето- @ -глюконовой кислоты Советский патент 1985 года по МПК C12P7/58 C12P7/58 C12R1/18 

Изобретение относится к техничес кой микробиологии, а именно к способу получения 2,5-дикето-1)-глюконовой кислоты (2,5-ДКГ) с использованием микроорганизмов продуцентов, относящихся к новым штаммам микроорганизмов рода Erwinia.

Известен способ получения 2,5-дикето-В-глютеновой кислоты путем культивирования аэробных микроорганизмов рода Pseudomonas fluorescens на питательной среде, содержащей D-глюкозу в качестве источника углерода, источники азота, фосфора, минеральные соли, стимуляторы рос-.. та 1 . ,

Известен также способ получения 2,5-ДКГ, согласно которому в качестве продуцента целевого продукта используют микроорганизмы рода Acetobacter, которые культивируют в условиях аэрации среды на питательной среде, содержащей D-глюкозу в качестве источника углерода, источник азота, фосфора, минеральные соли и стимулятор роста в условиях аэраци среды с последующим выделением целевого продукта 2 .

Согласно этому способу в питательную дополнительно вводят Ь-пролин, что способствует увеличению выхода, целевого продукта. Однако эта добавка хоть и увеличивает выход продукта, но не ускоряет процесс и к тому же его усложняет. Последний длится до 64 ч, что естественно приводит к большим расходам .энергии.

Целью изобретения является упрощение и ускорение процесса ферментации при высоком выходе целевого продукта.

Цель достигается тем-, что согласно способу получения 2,5-дикето-1)глюконовой кислоты путем культивирования ее продуцентов на питательной среде, содержащей Э-глюкозу в качестве источника углерода, источники азота, фосфора, минеральные соли и стимулятор роста, в условиях аэрации среды с последующим выделением из |кулътуральной среды целевого продук а, в качестве продуцентов используют штамм Erwinia citreus АТСС 31623 или штаммы Erwinia punctata АТСС 31624, или Erwinia punctata . АТСС 31625, или Erwinia punctata АТСС 31626, или Erwinia punctata АТСС 31627, или штагФ1Ь Erwinia terreus АТСС 31628, или Erwinia terreu АТСС 31629, или Erwinia terreus АТСС 31630, или Erwinia terreus АТСС 31631.

Согласно предлагаемому способу концентрацию О-глюкозы в среде следует устанавливать от 5 до 20 об.%.

Таким образом, предлагаемый способ можно осуществлять с использованием указанных штаммов рода Erwinia способных селективно окислять I)-глюкозу и превращать ее в 2,5-ДКГ.

Эти штаммы перечислены в табл, 1 Они хранятся в институте исследования ферментации в Японии и в Американской коллекции культур в Вашингтоне. ,

Данные таксономических исследований этих микроорганизмов представлены в табл. 2. .

А. Наблюдения.

1.Форма клеток (скошенный бульоный агар при 28°С в течение 2k, 72

и 168 ч).

Численно преобладают одиночные клетки, палочки указанных в таблице размеров с закругленными концами у всех штаммов. Иногда в некоторых наблюда отся деформированные клетки указанных размеров.

2.Подвижность и жгутикование (скошенный бульонный агар при 20 и 25С в течение 18-24 ч).

Подвижность определяют методом висящей капли.

Жгутикование подтверждается под оптическим микроскопом после окрашивания по методике Toda или при помощи просвечивающего электронного микроскопа после культивирования по методике культивирования в поддерживаемой мембране.

Штаммы SHS-2003, 2004, 2005, 2006 и 2007 подвижные.

Штамм SHS-2008 подвижный с монолатеральным жгутиком.

Штаммы SHS-2009, 2010 и 2011 подвижные с одним или двумя латеральными жгутиками. .

3.Споры не образуют ни один из приведенных штаммов.

4.Окрашивание по Граму (скошенный бульонный агар при в течение 24, 72, 168 ч). Отрицательная у всех из приведенных в таблице

: штаммов. 5, Кислотостойкость. У всех штаммов отрицательная. Ь. Рост на различных средах (табл. 3). 1.Колонии на бульонном агаре пр в течение 24, 48, 72 и 168 ч. Начальные колонии-все круглые, цельные, гладкие, прозрачные и маслянистые. 2.Скошенный бульонный агар при 28с в течение 24-168 ч (табл. 4). Начальные колонии все нитевидные и маслянистые. 3.Бульон при 28 С в течение 24-68 ч. У всех штаммов нет запаха (табл. 5). 4.Столбик бульонной желатины при 20 С в течение 40 дней. Все штаммы не разжижают. Рост вдоль оси столбика. 5.Лакмусовое молоко при 28 С в течение 40 дней. Штамм SHS-2003. Подкисление нач нается в течение 7 сут. Слабая рав мерная коагуляция начинается прибл зительно на 18-й день и заканчивается на 38-й день. С 18-го по 32-й день верхний слой становится розовы а нижний слой - серовато-коричневым но на 32-й день весь слой равномерн розовый. У штаммов SHS-2004, 2005, 2006, 2007, 2008, 2010 и 2011 в течение периода инкубации не замечено ника ких изменений, 6.Скошенный картофель при в течение 24-168 ч. Колонии у всех штаммов нитевидные, маслянистые и блестящие (табл. 6). В. Физиологические свойства (на основании результатов наблюдений при 28С в течение 14 дней, если отсутствуют другие указания). 1.Нитрит. Все штаммы продуцируют нитрит из нитрата. 2.Нитратное дыхание. У всех не наблюдается ни рост, ни продуцирование газа в запечатанном парафином .бульоне, содержащем 1% KNO. 3.Испытание с метилротом. У всех положительный, за исключением штамма SHS-2010 (слабо положительный). 4. Реакция Voges-Proskanera (глюкоза). У штамма SHS-2003 - слабо положительная. У штаммов SHS-2004 2005, 2007, 2008, 2010 и 2011 - положительная. У штаммов SHS-2006 и 924 2009 -т отрицательная или слабо положительная . 5.Индол. У всех штаммов - отруцательная. 6.Сероводород. Бактопептонная вода-свинцово- ацетатная реактивная бумага - у всех положительная. TSI-arap. У всех штаммов - отрицательная. Агар Klieglera. У всех штаммов отрицательная. 7.Аммиак. Все штаммы не продуцируют . 8.Гидролиз крахмала. Отрицательная у всех штаммов. 9.Рост на цитратных средах. Среда Simmona, дополненная витаминной смесью. Рост - у всех штаммов . Среда chrrstensina. Рост у всех штаммов. Рост на неорганических источниках азота. Аммиак (среда - глюкоза Huckera, дополненная витаминной смесью). Рост У всех. Нитрат (среда - глюкоза Dimmika, дополненная витаминной смесью). Рост наблюдается у штаммов SHS-2003, 2004, 2005, 2008, 2009, 2010 и 2011, штамм SHS-2006 не растет, а штамм SHS-2007 растет очень слабо, 11. Пигмент (культура штрихом на чашках Петри). Синий пигмент (дрожжевой экстракт 1%, глюкоза 1%, СаСО, 2% при 28с в течение 7 дней). У всех негативная. отрицательная. Розовый, способный к диффузии пигмент (среда аналогично приведенной), У всех штаммов - отрицательная. Желтыр пигмент (бульонный агар при 28с в течение 7 дн.). У всех штаммов - отрицательная. 12.Уреаза. У всех штаммов - отрицательная . 13.Каталаза. У всех штаммов отрицательная. (4. Оксидаза (скошенный бульонный агар, содержащий тетраметилфенилендиамин, в течение 18-24 ч). Отрицательная у всех штаммов. 15. Температурная зависимость (бактодрожжевой экстракт 0,5%, бактопептон 0,5% и глюкоза 0,5%, рН 7) представлена в табл. 7.

16.Зависимость от рН (глицерин 1%, бактодрожже.вой экстракт 0,5%,

бактопептон 1%, хлорид на5трия 0,5%, в буфере 0,1 М 3,3-диметилглутарово кислоте, 28 С в течение 2-4 дней) представлена в табл. 8.

17.Потребность в кислороде. У всех штаммов - факультативная.

Палочковая культура, запечатанная жидким парафином. В этом случае среду глюкоза-ВСР, содержащую, %: бактомясной экстракт 1, бактопептон 1, бактодрожжевой экстракт 0,2, хлорид натрия 0,5, бромкрезол пурпурный 0,004 и порошок агара 1,5 (рН 7,0-7,2), разлили в пробирки диаметром 18 мм и высотой около 8 с и стерилизовали при 121 С в течение 15 мин. Столбики инокулировали до полного затвердевания среды. Затем пробирки запечатали стерильным жидКИМ парафином (5-7 мл) на глубину 4 см, культивировали при 28 С и наблюдали спустя 7 дней.

При значительном росте вдоль оси палочек сверху до дна среды в течение 2-3 дней культура начала равномерно окрашиваться в бледно-желтый цвет, показывая отчетливую разНиду в окраске каждого из приведенных в таблице, штаммов по сравнению с контрольной запечатанной неинокулирован ной пробиркой. С течением времени интенсивность желтой окраски возрастала.

Анаэробная.система газ-Рак (ВВ L).

Использовали чашку Петри с бакто питательным агаром, содержащим, %: бактомясной экстракт 1, бактопептон 1, хлорид натрия 0,5 и порошок агара 1,5, или чашку Петри с агаром I УР, содержащим, %: глицерин 0,5; бактодрожжевой экстракт 0,5; бактопептон 0,3; KHjPO 0,1;- M. 0,02; порошок агара 1,5; рН 7,0-7,2 Слабый посев штрихом суспензии Испытуемого организма культивировали : при 2Р. С в течение 48 ч после удаления кислорода путем двухчасовой, реакции при 45С в инкубаторе.

У всех штаммов наблюдался слабый рост, слабее чем у Escherichia coli, взятой для контроля.

18(Тест открытого поля. У всех штаммов - ферментативная. Среду, содержащую, %: бактотриптон 1 : , бактодрожжевой экстракт 0,1; бромкрезол

пурпурный 0,004; глюкозу (или лактозу) 1% и порошок агара 0,2; pi 7,0-7,2, разлили в пробирки (дияметр 18 мм) на глубину приблизительно 8 см и стерилизовали при 121 С в течение 15 мин. После достижения температуры среды приблизительно 30-40 С продублирована инокуляция для каждого организма из приведенных в таблице штаммов. Затем одну пробирку из каждой пары запечатали стерильным жидким парафином (5-7 мл) на глубину приблизительно 4 см, культивировали, при 28 С и вели за ними наблюдение в течение 7 дней.

Продуцируют кислоту как в аэробных, так и анаэробных условиях из D-ГЛЮКОЗЬГ (а также из лактозы в случае SHS-2003) , газ не продуцирует. Наблюдается отчетливый рост вдоль оси палочек сверху до дна как в запечатанной, так и в, незапечатанной культуре.

Продуцируют кислоту в анаэробных условиях не так быстро, как Escherichia cioli, взятую для контроля.

19.Продуцирование кислот и газов из углеводородов показано в табл. 9 и 10.

20.Метиленовая синь (бульон, 18-24 ч). Все штаммы восстанавливают

21.D-глюконовая кислота. Все штаммы и спользуют.

22.2-Кето-0-глюконовая кислота. Используют все штаммы.

23i Продуцирование восстановленных соединений из сахарозы.Положительная у всех штаммов за исключение штамма SHS-2003.

24.Декарбоксилирование различных аминокислот.

D-глютаминовая кислота. Отрицательная у штаммов SHS-2003, 2008, 2009, 2010 и 2011; положительная у штаммов SHS-2004, 2005, 2006 и 2007.

L-лизин. Отрицательная у всех штаммов.

L-аргинин. Отрицательная у всех штаммов.

L-орнитин. Отрицательная у всех гптаммов.

25.Липаза. Отрицательная у всех штаммов.

26.Окисление глюконата. Положительная у всех штаммов.

27.Разложение пектата. Отрицательная у всех штаммов. 28.Гидролиз казеина. Отридатель ная у.всех штаммов. 29.Симплазмата. Отрицательная у штамт-юв SHS-2003, 2004, 2005, 2007, 2008 и 2009. Положительная у штаммов SHS-2006, 2010 и 2011. 30.D-Наза (бакто-П-наза испытуемый агар). Отрицательная у всех штаммов. 31.Фенилаланин-дезаминаза (сред фенилаланин/малоновая кислота). У штаммов SHS-2003, 2008, 2009, 2010 и 2011 отрицательная или слабоположительная; у штаммов SHS-2004, 2005 2006 и 2007 отрицательная. 32.Подавление KCN. Положительн у нсех штаммов. 33.Рост в 5%-ном бульоне хлорид натрия. Положительный у всех штаммов . 34.Ауксртрофия (среда Grayand Tatunia). Требуется никотиновая кис лота или никотинамид всем штаммам. 35.Использование некоторых соединений (среда ОУ, 28°С, 20 и 44 ч, встряхивание) представлено в табл. 1 36..Убихинон. Штаммы SHS-2003 и 2008 - убихинон-8 (и убихинон-7). Штаммы SHS-2004, 2005, 2006, 2007, 2009, 2010 и 2011 - убихинонГ. Происхождение. Штаммы SHS-2003, 2004, 2006, 2007, 2010 и 2011 - мандарин благородньй. Штаммы SHS-2005. и 2009 - хурма, виргинская. Штамм SHS-2008 - почва. 111таммы в табл. 1 определены путем сравнения упомянутых таксономических свойств соответствующих штаммов в табл. 2 с известньми. 1.Распределение в,пределах семей ства . На основании описанньпс результатов наблюдения можно сделать вывод, что все приведенные в таблицах штам мы являются короткими палочками грамотрицательных и факультативных анаэробов, которые не образуют споры и проявляют каталазную активность,. но/не обладают оксидазной активностью, они отнесены к семейству Enterobacterialceae. 2.Распределение з пределах рода Все приведенные в таблицах штаммы отнесены к роду Erurieia на основан таксономических свойств, в частност они продуцируют кислоты из чР-метилглюкозида и сахарозы (за исключением штамма SHS-2003, который не продуцирует кислоту из сахарозы, но использует последнюю в качестве единственного источника углерода), но не из адонита, дульцита или мелецитозы, не используют бензоат, оксалат и пропионат, не способны гидролизовать крахмал, не способны декарбоксилиро-вать глутаминовую кислоту, аргинин, лизин и ортинин (за исключением штаммов SHS-2004,- 2005 и 2007, которые декарбоксилируют глутаминовую кислоту) и не проявляют уреазной или липазной активности. 3. Распределение в пределах вида. Хотя штамм SHS-2003 считается близким к Erwinia stewartu группы herbicola на основании отсутствия жгутикования, однако у него -имеются другие таксономические свойства, сильно отличающиеся от свойств Erwinia stewartu в потребности в никотиновой кислоте или никотинамиде для роста, в продуцировании сероводорода из цистеина, в восстановлении нитратов в нитриты, в непродуцировании кислоты из сахарозы (хотя он не может продуцировать кислоту из сахарозы, однако использует сахарозу в качестве единственного источника углерода), арабинозы, рафинозы или сорбита, в продуцировании кислоты из сал1щина, целлсбиозы и глицерина, в неиспользовании тертраты в качестве единственного источника углерода. Кроме того, так как этот штамм не показал совпадения с любыми другими известными видами рода, его следует отнести к новым видам, предлагаемого изобретения Erwinia Citreus. Хотя штаммы SHS-2004, 2005, 2006 и 2007 считаются близкими к Erwinia stewartu с точки зрения отсутствия жгутикования, однако они обладают таксономическими свойствами, сильно отличающимися от свойств Erwinia stewartu в потребности в никотиновой или никотинамиде для роста, в продуцировании сероводорода из цистеина, в восстановлении нитратов в нитриты, декарбоксилировании глутаминовой кислоты. Кроме того, они не продуцируют кислоты из арабинозы, маниита, лактозы или сорбита, но продуцируют кислоты из салицина и целлобиозы и не используют тартраты 9 в качестве единственного источника углерода.. Кроме того,, эти штаммы -отличают от описанного штамма ЗН8-20ЬЗ тем, что декарбоксилируют глутаминовую кислоту, почти не используют лакто ацетат и лактат в качестве единстве ного источника углерода, не продуци руют кислоты из маннита и лактозы, не обладают активностью к лакмусовом молоку. Поскольку эти штаммы не показали совпадения с любыми другими известн ми видами рода, их следует отнести jHOBOMy виду, названному Erwinia pun tata.: . Из этих штаммов штаммы SHS-2004 и 2006 не продуцируют кислоту из . рафинозы и не используют маннит, ацетат или лактат, - Но штамм SHS-2004 отличается от штамма SHS-2006 тем, что продуцируе ацетоин из глюкозы, использует нитрат в качестве источника азота, продуцирует кислоту из глицерина и использует формиат в качестве единственного источника углерода. Штамм SHS-2005 как и штамм SHS-2006 почти .не способен использо вать маннит, ацетат и лактат в качестве единственного источника углерода-, однако первый отличается от последнего тем, что продуцирует кислоту из глицерина, ацетоин из глюкозы, образует флуоресцирующие пигменты в среде King В, почти не продуцирует кислоту из рафинозы и использует формиат в качестве единственного источника углерода. Кроме того, штамм SHS-2007 и штамм SKS-2006 почти не способен использовать маннит, ацетат и лакта в качестве единственного источника углерода, однако первый отличается от последнего тем, что продуцирует кислоту из рафинозы, ацетоин из глюкозы, использует формиат как единственный источник углерода и имеет широкий диапазон температуры роста 4,0-47,5С. На основании указанных результатов наблюдений все штаммы SHS-2004, 2005, 2006 и 2007 отнесены к Erwini punctata и. каждый из них представляет вариант по отношению к остальным . Хотя штаммы SHS-2008 и 2010 близ ки к En rinia tracheiphila или 9210 . Erwinia guereina с точки зрения их подвижности с монолатёральным жгутиком, но их таксономические свойства сипьно отличаются от свойств Erwihia tracheiphila в следующем: рост при температуре выше 36 С, обильный рост на бульонном агаре, показывают мукоидный рост, восстанавливают нитраты в нитриты, продуцируют кислоты из салицина, ксилозы, мелибиозы и маннозы и используют лактат в качестве единственного источника углерода. Кроме того, имеются различия меж.ду их таксономическими свойствами и свойствами Erwinia guerina в том , что они окисляют глюконовую кислоту, восстанавливают нитраты в нитриты, . продуцируют кислоты из мелибиозы и целлобиозы, не продуцируют кислоты из маннита, uJ-метилглюкозида, эзуклина и сорбита, не продуцируют газ на глюкозопептонной среде. Кроме того, поскольку эти штаммы не совпадают ни с какими другими известными видами рода, целесообразно отнести их к виду Erwinia. Штамм SHS-2010 показывает значительное совпадение со. штаммом SHS-2008 за исключением некоторых различий, которые заключаются в том, что он не продуцирует кислоту из глицерина, SHS-2008 продуцирует хислоту из рибозы, а SHS-2010 почти не продуцирует ее. Кроме того, у него слабо положительная реакция в тесте с метилротом и он образует флоуресцирующие пигменты на среде. . Штамм SHS-2009 близок к Erwinia tracheipVdla, Е. guerce/.na и Е. herbicola с точки зрения по.движности с монолатеральным жгутиком. Однако имеется заметная разница между таксономическими свойствами этого штамма и свойствами Erwinia tracheiphila в том, что наблюдается обильный рост на бульонном агаре, рост при температуре выше 36 С. Кро-. ме того, он показывает мукоидный рост, восстанавливает нитраты в нитриты, продуцирует кислоты из салицина, ксилозы, мелибиозы, целлобиозы, глицерина и маннозы. Найдено также заметное отличие от свойства Erwinia guereina в окислении глюконата, восстановлении нитратов в нитриты, слабом образовании ацетоина и глюкозы, продуцировании кислот из ксилозы, мелибиозы и целлобиозы. Кроме TorojOH не продуцирует кислот из маннита, oi-метилглюкоэида, эзуклина, рибозы или сорбита, не исполь зует тертрат в качестве единственного источника углерода и не продуцирует газ на глюкозопептонной среде. Отличия свойств штамма SHS-2010 от свойств Erwinia herbicola var herbicola состоят в его потребности в никотиновой кислоте или никотинамиде для роста, в слабом образовани ацетоина из глюкозы, он не. разжижае желатину, продуцирует кислоты из мелибиозы, целлобиозы и глицерина, продуцирует кислоты из арабинозы, маннита, мальтозы, декстрина, рамнозы, рибозы или сорбита. Хотя остаются еще некоторые различия при сравнении этого штамма. с ранее определенным штаммом SHS-2008 в слабом образовании ацето ина из глюкозы, в непродуцировании кислоты из рибозы, однако первый штамм совпадает с последним по другим ;преобладающим свойствам и, следовательно, идентифицирован как вариант определенного ранее штамма. Штамм SHS-2011 близок к Erwinia tracheiphila или Erwinia. amylavara 1с точки зрения подвижности с моношатеральным жгутиком. При сравнении свойств этого штам ма со свойствами Erwinia tracheiphila различия состоят в его умеренном росте в бульонном агаре, росте при температуре вьш1е . Кроме того, он показывает мукоидный рост, восстанавливает нитраты в нитриты, продуцирует кислоты из салицина, ксил зы, мелибиозы, деллобиозыиманнозы и использует лактат в количестве един ственного источника углерода. При сравнении свойств этого штам ма со свойствами Erwinia amylovola различия состоят в образовании серо водорода из цистеина, росте при температуре и выше, восстановлении нитратов в нитриты. Кроме тог он не разжижает желатину, продуцирует кислоты из салицина, ксилозы, мелибиозы, целлобиозы и маннозы, не продуцирует кислоту из рибозы. При сравнении со штакмом SHS-2008 этот штамм совпадает с последним по свойствам, однако не продуцирует кислоту из рибозы или глицерина и идентифициров.ан как вариант определенного ранее штамма. Определенные микроорганизмы обильно растут в водной питательной среде, содержащей D-глюкозу в качестве о новного источника углерода, настой кукурузы в качестве источника азота и небольшое количество неорганических солей. Если их культивируют в аэробных условиях, они растут на среде с очень большой концентрацией D-глюкозы с достаточной стабильностью для продуцирования 2,5-дикето-В-глюконовой кислоты (2,5-ДКГ) с хорошим выходом по сравнению с известными микроорганизмами, применяющимися для получения этого продукта. Концентрация D-глюкозы в бульоне может достигать при необходимости АО об.%, хотя с экономической точки зрения целесообразно для получения 2,5-дикето-В-глюконовой кислоты поддерживать концентрацию D-глюкозы в интервале 15-25 об.%, более предпочтительно . 20 об.%. Температура сбраживаемой среды 15-35с предпочтительно 20-30 Си может состаВоПять , Начальные значения рН среды должны быть в ин- . тервале 5,5-7,5, предпочтительно 6,0-7,0. Значения рН среды можно- поддерживать во время ферментации в требуемом интервале А,0-5,5 путем введения неорганических солей, например карбоната кальция, обладающих буферным действием, в исходную среду или введением оснований, например гидроксида натрия, в среду по мере прртекания процесса ферментации. Инокулированную сбраживаемую среду следует непрерывно перемешивать мешалкой (приблизительно 17АОоб/мий) при аэрации в количестве приблизительно 600 Н. мл/мин. Брожение заканчивается спустя 17-31 ч с начала процесса, когда превращение D-глюкозы в 2,5-ДКГ достигает значения, которое соответствует выходу приблизительно 90%. Накапливающаяся 2,5-ДКГ или ее соли могут быть выделены из культуральНой жидкости в виде кристаллов после обработки любым способом, например регулированием рН, или среда может быть успешно использована как таковая в качестве питательной среды на следукяцей стадии. Например, среда, содержащая 2,5-ДКГ, может быть непосредственно применена для получения 2-кето-1.-гулоново кислоты. Таким образом, последняя может быть получена с большим выходом по упрощенной технологии.

Предлагаемый способ может быть также практически осуществлен путе простого контактирования любого из продуктов, полученных обработко клеток указанных микроорганизмов, любым из субстратов, срдержащих D-глюкозу.

Пример 1. Для посева испозуют среду (водный раствор), содержащую, об.%:

D-глюкоза (гидра. тированная, содержание 91%)1,0 .Настой кукурузы (CSL) 5,0 Дигидрофосфат калия () 0,1 Сульфат магния (MgS04-7H20) 0,02 Карбонат кальдня (СаСО)0,5

Среду доводят до рН 6,8-7,0 при помощи 10%-ного водного раствора едкого натра, делят на порции по 50 мл и помещают в стерилизованные конические колбы емкостью 500 мл.

Каждую порцию среды в колбе инокулируют полной петлей одного из штаммов, приведенных в табл. 3, и встряхивают (ход 71 мм, 270 ударов в минуту) при температуре в течение приблизительно 8 ч. Культивирование заканчивается, когда оптическая плотность (OD) среды достигает приблизительно 8 (конечная точка)..

Таким образом получают культуру для посева. i.

Сбраживаемую среду (водньш раствор) готовят следующего состава,

об.%: ...

20,0 3,0

0,1

6,3 50

Доводят рН сбраживаемой среды до 6,8-7,0, делят на порции по 455 мл и помещают в ферментеры емкостью 1 л. В каждый из ферментеров добавляют по 45 мл указанной среды для посева Затем осуществляют сбраживание при .следующих условиях:

Температура, С 28 Перемешивание, об/мин 1740

Аэрация, Н. мл/мин 600 Продолжительность, ч 17-31 Полученный продукт хроматографируют на носителе фильтровальной бумаги путем капиллярного поднятия и коколичественно определяют пятна методом денситометрии. При этом используют носитель Тоуе Roshi № 50 и проявляющий растворитель - фенол : муравьиная кислота : вода, взятые в соотношении 75 : 4 : 25.

Для проведения окрашивания набрызгивают раствор насьш1енного водой н-бутанола (100 мл), содержащего анилин (0,93 г) и фталевую кислоту (1,66 г), и проводят последующую обра отку при 105 С в течение 2 мин дл проявления окраски. Результаты представлены в табл. 12.

Кроме того, проведена также тонкослойная, хроматография с TLC allumisheet cellolose и с описанными системой проявляющего растворителя . и методикой окраски. В этом случае определение осуществляют путем сравнения хроматограмм с хроматограммами полученными для аутентичных экземпляров.

Брожение заканчивается, розовое пятно 2-кето-В-глкконовой кислоты исчезает с указанной бумаги или с тонкослойной хроматограммы. Результаты, полученные после инкубации штаммов, представлены в табл. 13

Пример 2. Продуцирование с применением суспензии клеток и сырого экстракта фермента. Для получения клеток микроорганизмов использую.т среду (водный раствор) следующего составаJ об.%:

КН,,,1

Na2S04-7H20О.,02

СаСО50,6

Среду доводят до рН 7,0, делят на порции по 80 мл и помещают в конические колбы емкостью 500 мл.

Каждую из указанных сред инокулируют соответствующим штаммо.м (табл.4 по способу, описанному в примере 1, и встряхивают (ход 71 мм, 270 ударов в минуту) при в течение 16 ч.

После встряхивания клетки микроорганизмов отделяют центрифугированием культуральной среды, дважды

15

промывают солевым раствором и делят на две части.

Одну из указанных частей суспендируют снова солевым раствором и получают суспензию клеток. Вторую часть суспендируют в буфере 1/50 М трис-НС1 (рН 7,5), измельчают ультр звуком, центрифугированием удаляют нерастворимый остаток и получают сырой ферментный экстракт в виде .всплывшего слоя.

Затем осуществляют инкубации с клеточной суспензией и с сырым ферментным экстрактом соответственно.

При инкубации с клеточной суспензией готовят смесь из буфера 0,1 М 3,3-диметилглутаровой кислоты (рН 5,0), содержащего приблизительно 5 об.% D-глюкозы, в которой концентрацию клеток регулируют так, чтобы OD при 660 М Ш быпа приблизительно 10. Смесь делят на порции по 10 мл, помещают в пробирки 23 мм (диаметр) х 196 мм (высота) и инкубируют при 28 С в течение 3ч.

Затем смесь центрифугируют, образуется всплывший слой, который

9099216

анализируют методом бумажной хроматографии.

Результаты, полученные после инкубации с клеточной суспензией, а также концентрация D-глюкозы в смеси до инкубации представлены в табл. 14.

При инкубации с сырым ферментным экстрактом к смеси, приготовленной аналогично описанному, добавляют сырой ферментный экстракт так, чтобы его концентрация,выраженная количеством протеина, составляла 0,25 мг/л. После встряхивания аналогично описанному смесь обрабатывают двумя каплями 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты для удаления протеиновой части и хроматографируют на фильтровальной бумаге. Результаты, полученные после инкубации с сырым ферментным экстрактом, представлены в табл. 15.

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает высокий выход 25 2-кето-В-глюконовой кислоты за 17-31 ч ферментации, что ускоряет и упрощает процесс ее получения.

Таблица 1

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 2,5-ДИКЕТО-1)-ГЛЮКОНОВОЙ КИСЛОТЫ путем культивирования ее продуцентов на питательной среде, содержащей П-глюкозу в качестве источника углерода, источники азота, фосфора, минеральные соли и стимулятор роста, в условиях аэрации среды с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения процесса ферментации при высоком выходе целевого продукта, в качестве продуцентов используют штамм Erwinia citreus АТСС 31623 или штаммы Erwinia punctata АТСС 31624, или Erwinia punctata АТСС 31625, или Erwinia punctata АТСС 31626, или Erwinia punetata АТСС 31627, или штаммы Erwinia terreus АТСС 31628, или Erwinia terreus АТСС 31629, или Erwinia terreus АТСС 31630,или Erwinia terreus АТСС 31631. 2. Способ по п. 1, о т л и ч щ и и с я тем, что концентрацию0-глюкозы в среде устанавливают от 5 до 20 об.%.

Таблица 2

2009

Бледно-бежевая

Блестящая

2010 То же

То же

2011

Бледно-красно-желтая

Гладкая, но постепенно меняется до шероховатой и рельефной

Выпуклая, но постепенно меняется до взгорбленной

Выпуклая, но постепенно меняется до плоской. Липкая, но постепенно меняется до маслянистой, .

f а б п я ц а 4

Таблица

Обильный

Вледно-красно-желтая

Бежевая

Умеренный

Бледно-бежевая Бежевая

Обильньй

Умеренный

Таблица 7

Таблица 9

+

+. + Примечание. Примечание. Продуцирует кислоту без газа (); не продуцирует ни кислоту, ни газ (-); слабо продуцирует кислоту без газа (±), Использует в качестве единственного источника углерода (+); слабо использует или не использует в качестве единственного источника углерода (-); не использует (-). Т.аблица И

Таблица 15