СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ β-ФРУКТОФУРАНОЗИДАЗЫ Российский патент 2008 года по МПК C12N11/00 C12N11/04 C12N11/12 C12N11/14 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения иммобилизованной β-фруктофуранозидазы, и может быть использовано при производстве инвертного сахара.

Известен способ получения иммобилизованной β-фруктофуранозидазы (инвертазы) для гидролиза сахарозы, включающий получение очищенной β-фруктофуранозидазы из содержимого клеток дрожжей, иммобилизацию ее на модифицированных кремнеземных сорбентах, при этом в процессе порционного связывания инвертазы с сорбентами осуществляют многократную обработку инвертазы глутаровым альдегидом (а.с. СССР N 1564186, М. кл. С12Н 11/00, публ. 1990 г.).

Недостатками известного способа является достаточно трудоемкий процесс в связи с необходимостью осуществления сложной процедуры специальной очистки фермента, а обработка глутаровым альдегидом приводит к резкому снижению активности β-фруктофуранозидазы.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения иммобилизованной инвертазы, включающий автолитическую деструкцию клеток дрожжей, обладающих инвертазной активностью, получение препарата инвертазы и его последующую иммобилизацию на поверхности или в массе твердого или гелеобразного носителя, причем в качестве препарата инвертазы используют изолированные стенки дрожжевых клеток, разрушенных в процессе автолиза [Патент N 2158761 RU Е.М.Рязанов, Д.И.Островский, А.В.Бубнов Способ получения иммобилизованной инвертазы для гидролиза сахарозы].

Недостатком известного способа является сложность осуществления способа, возможность загрязнения целевого продукта (инвертного сахара) ионами металлов и большим количеством балластных веществ, выходящих из иммобилизованным клеток микроорганизмов.

Технической задачей настоящего изобретения является упрощение и повышение эффективности способа получения иммобилизованной β-фруктофуранозидазы при сохранении ее высокой ферментативной активности и обеспечение чистоты целевого продукта.

Техническая задача достигается тем, что способ получения иммобилизованной β-фруктофуранозидазы характеризуется тем, что оживляют чистую культуру Klyuveromyces marxianus Y-303 по методу Коха, затем засевают ее в чашки Петри с 2%-ным сусло-агаром при температуре 48-50°С, чашки переворачивают вверх дном и выдерживают в течение 2-3 суток в термостате при температуре 28-30°С, затем выросшие колонии переносят в чашку Петри с сусло-агаром для наращивания биомассы, после чего дрожжи переносят на скосы с сусло-агаром, далее проводят глубинное культивирование дрожжей Klyuveromyces marxianus Y-303 в колбах емкостью 500 см³, содержащих по 50 см³ питательной среды, в качестве которой используют пивное сусло, в течение 47,5-48,5 ч при температуре 30°С, затем выращенную биомассу дрожжей смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:5 и проводят автолиз при температуре 38-42°С в течение 59,5-60,5 ч, полученную после автолиза ферментсодержащую смесь осаждают этиловым спиртом при рН 5,0 или ацетоном при рН 5,5, затем проводят очистку β-фруктофуранозидазы в 3 стадии: удаляют низкомолекулярные примеси гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-25 (Fine, 1,4×20 см), повышают чистоту ферментного препарата ионообменной хроматографией на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой (0,8×13 см), фракционируют на колонке с сефадексом G-150, после очистки фермента осуществляют концентрирование на мембране Amicon РМ-30 до 5 см³ и направляют на лиофильную сушку при t=-30°С, после чего осуществляют иммобилизацию β-фруктофуранозидазы на полимерном волокнистом сорбенте (анионите) марки ФИБАН® (Беларусь), причем перед процессом иммобилизации сорбент обрабатывают 5%-ной соляной кислотой, дистиллированной водой, 5%-ным раствором едкого натра и снова водой, каждая обработка длится 12 ч, промытый сорбент дополнительно обрабатывают 95%-ным этиловым спиртом и снова водой, далее готовят водный раствор β-фруктофуранозидазы с содержанием 0,018-0,098 моль/дм³ и инкубируют подготовленный сорбент.

Технический результат заключается в упрощении и повышении эффективности способа получения иммобилизованной β-фруктофуранозидазы при сохранении ее высокой ферментативной активности и обеспечении чистоты целевого продукта.

Способ получения иммобилизованной β-фруктофуранозидазы осуществляется следующим образом.

Используемые в работе дрожжи Klyuveromyces marxianus Y-303 хранят в запаянных ампулах. Оживление чистой культуры Klyuveromyces marxianus Y-303 проводят по методу Коха. Культуру дрожжей засевают в чашки Петри с 2%-ным сусло-агаром при температуре 48-50°С, чашки переворачивают вверх дном и выдерживают в течение 2-3 суток в термостате при температуре 28-30°С. Выросшие колонии переносят в чашку Петри с сусло-агаром, по истечении 2-3 суток дрожжи переносят на скосы с сусло-агаром. Далее проводят глубинное культивирование дрожжей Klyuveromyces marxianus Y-303 в колбах емкостью 500 см³ в термостате, содержащих по 50 см³ питательной среды, в качестве которой используют пивное сусло, в течение 47,5-48,5 ч при температуре 30°С. Затем выращенную биомассу дрожжей смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:5 и проводят автолиз при температуре 38-42°С в течение 59,5-60,5 ч. Полученную после автолиза ферментсодержащую смесь осаждают этиловым спиртом при рН 5,0 или ацетоном при рН 5,5, затем проводят очистку β-фруктофуранозидазы в 3 стадии: гель-фильтрация на колонке с сефадексом G-25 (Fine, 1,4×20 см) с целью освобождения от низкомолекулярных примесей, ионообменная хроматография на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой (0,8×13 см) для повышения чистоты ферментного препарата, фракционирование на колонке с сефадексом G-150, после очистки фермента осуществляют концентрирование на мембране Amicon РМ-30 до 5 см³ и направляют на лиофильную сушку при t=-30°С.

Иммобилизацию β-фруктофуранозидазы проводят на полимерном волокнистом сорбенте марки ФИБАН® (Беларусь). Подготовка сорбента проводится в соответствии с ГОСТ 10896-72. Кондиционирование анионита осуществляют обработкой 5%-ной соляной кислотой, дистиллированной водой, 5%-ным раствором едкого натра и снова водой. Каждая обработка длится 12 ч. Каждый реагент берут в 2-кратном избытке по сравнению с содержанием обменных групп в обрабатываемом образце. Кондиционирование проводят на воронке с пористым фильтром. Промытый сорбент с целью очистки дополнительно обрабатывают 95%-ным этиловым спиртом и снова водой. Далее готовят водный раствор β-фруктофуранозидазы с содержанием 0,018-0,098 моль/дм³ и инкубируют подготовленный сорбент.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Культивирование дрожжей Klyuveromyces marxianus Y-303 проводят в чашках Петри с 2%-ным сусло-агаром при температуре 29°С в течение 2 суток, выросшие колонии переносят на скосы с сусло-агаром, после чего проводят глубинное культивирование в колбах емкостью 500 см³ в термостате, содержащих по 50 см³ питательной среды, в качестве которой используют пивное сусло, в течение 48 ч при температуре 30°С. Затем выращенную биомассу дрожжей смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:5 и проводят автолиз при температуре 40°С в течение 60 ч. Полученную после автолиза ферментсодержащую смесь осаждают этиловым спиртом при рН 5,0 или ацетоном при рН 5,5, затем проводят очистку (β-фруктофуранозидазы в 3 стадии: гель-фильтрация на колонке с сефадексом G-25 (Fine, 1,4×20 см), ионообменная хроматография на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой (0,8×13 см), фракционирование на колонке с сефадексом G-150, после очистки фермента осуществляют концентрирование на мембране Amicon РМ-30 до 5 см³ и направляют на лиофильную сушку при t=-30°С.

Готовят водный раствор, содержащий β-фруктофуранозидазу в количестве 0,098 моль/дм³. Раствор пропускают через слой ионообменного волокнистого материала марки ФИБАН® (Беларусь). Подготовка сорбента проводится в соответствии с ГОСТ 10896-72. Кондиционирование анионита осуществляют обработкой 5%-ной соляной кислотой, дистиллированной водой, 5%-ным раствором едкого натра и снова водой. Каждая обработка длится 12 ч. Промытый сорбент с целью очистки дополнительно обрабатывают 95%-ным этиловым спиртом и снова водой.

Далее смолу инкубируют с раствором β-фруктофуранозидазы. Способ осуществим. Результаты осуществления способа приведены в табл.1; результаты сравнения предлагаемого способа и способа-прототипа представлены в табл.2.

Пример 2. Готовят водный раствор, содержащий β-фруктофуранозидазу в количестве 0,044 моль/дм³. Получение ферментного препарата и подготовку ионообменного волокнистого материала марки ФИБАН® проводят по методике, описанной в примере 1. Способ осуществим. Результаты осуществления способа приведены в табл.1.

Пример 3. Готовят водный раствор, содержащий β-фруктофуранозидазу в количестве 0,018 моль/дм³. Получение ферментного препарата и подготовку ионообменного волокнистого материала марки ФИБАН® проводят по методике, описанной в примере 1. Способ осуществим. Результаты осуществления способа приведены в табл.1.

Как видно из примеров, предложенный способ получения иммобилизованной β-фруктофуранозидазы осуществим при культивировании дрожжей Klyuveromyces marxianus Y-303 при температуре 28-30°С в течение 2-3 суток, глубинном культивировании в колбах емкостью 500 см³ в термостате, содержащих по 50 см³ питательной среды, в качестве которой используют пивное сусло, в течение 47,5-48,5 ч при температуре 30°С, проведении автолиза при температуре 38-40°С в течение 59,5-60,5 ч, осаждении ферментсодержащей смеси спиртом при рН 5,0 или ацетоном при рН 5,5 и очистке β-фруктофуранозидазы в 3 стадии: гель-фильтрация на колонке с сефадексом G-25 (Fine, 1,4×20 см), ионообменная хроматография на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой (0,8×13 см), фракционирование на колонке с сефадексом G-150. Как видно из табл.1, предложенный способ иммобилизации осуществим при содержаниях данного фермента в количествах 0,018-0,098 моль/дм³ (способ 1-3), при увеличении концентрации β-фруктофуранозидазы свыше 0,098 моль/дм³ приводит к переходу процесса иммобилизации к фильтрованию ферментного препарата ионообменным волокнистым материалом, снижение концентрации β-фруктофуранозидазы ниже 0,018 моль/дм³ приводит к невозможности определения содержания иммобилизованного фермента.

Предлагаемый способ получения иммобилизованной β-фруктофуранозидазы позволяет:

получить иммобилизованный препарат, отличающийся хорошей операционной стабильностью и активностью,

обеспечить чистоту продукта,

упростить способ иммобилизации β-фруктофуранозидазы,

снизить себестоимость осуществляемого способа.

Таблица 1Примеры осуществления способаНомер примераКонцентрация раствора фермента, моль/дм³Содержание иммобилизованного фермента, мг/гРезультат анализа10,0980,025Способ осуществим20,0570,0125Способ осуществим30,0440,0075Способ осуществим40,0310,005Способ осуществим

Способ включает оживление чистой культуры Klyuveromyces marxianus Y-303 по методу Коха, засев ее в чашки Петри с 2%-ным сусло-агаром при температуре 48-50°С. Чашки переворачивают вверх дном и выдерживают в течение 2-3 суток в термостате при температуре 28-30°С. Выросшие колонии переносят в чашку Петри с сусло-агаром для наращивания биомассы, затем на скосы с сусло-агаром. Проводят глубинное культивирование дрожжей в колбах емкостью 500 см³, содержащих по 50 см³ пивного сусла в течение 47,5-48,5 ч при температуре 30°С. Выращенную биомассу смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:5, проводят автолиз при температуре 38-42°С в течение 59,5-60,5ч. Полученную ферментсодержащую смесь осаждают этиловым спиртом при рН 5,0 или ацетоном при рН 5,5. Проводят очистку β-фруктофуранозидазы в 3 стадии: удаляют низкомолекулярные примеси гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-25, повышают чистоту ферментного препарата ионообменной хроматографией на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, фракционируют на колонке с сефадексом G-150. Осуществляют концентрирование на мембране Amicon РМ-30 до 5 см³, направляют на лиофильную сушку при t=-30°C. Осуществляют иммобилизацию β-фруктофуранозидазы на полимерном волокнистом сорбенте (анионите). Перед иммобилизацией сорбент обрабатывают 5%-ной соляной кислотой, дистиллированной водой, 5%-ным раствором едкого натра и снова водой. Каждая обработка длится 12 ч. Промытый сорбент дополнительно обрабатывают 95%-ным этиловым спиртом и снова водой. Готовят водный раствор β-фруктофуранозидазы с содержанием 0,018-0,098 моль/дм³ и инкубируют подготовленный сорбент. Способ позволяет получить иммобилизованный фермент в количестве 0,005-0,025 мг/г, обеспечить чистоту целевого продукта. 2 табл.

Способ получения иммобилизованной β-фруктофуранозидазы, характеризующийся тем, что оживляют чистую культуру Klyuveromyces marxianus Y-303 по методу Коха, затем засевают ее в чашки Петри с 2%-м сусло-агаром при температуре 48-50°С, чашки переворачивают вверх дном и выдерживают в течение 2-3 суток в термостате при температуре 28-30°С, затем выросшие колонии переносят в чашку Петри с сусло-агаром для наращивания биомассы, после чего дрожжи переносят на скосы с сусло-агаром, далее проводят глубинное культивирование дрожжей Klyuveromyces marxianus Y-303 в колбах емкостью 500 см³, содержащих по 50 см³ питательной среды, в качестве которой используют пивное сусло, в течение 47,5-48,5 ч при температуре 30°С, затем выращенную биомассу дрожжей смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:5 и проводят автолиз при температуре 38-42°С в течение 59,5-60,5 ч, полученную после автолиза ферментсодержащую смесь осаждают этиловым спиртом при рН 5,0 или ацетоном при рН 5,5, затем проводят очистку β-фруктофуранозидазы в 3 стадии: удаляют низкомолекулярные примеси гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-25, повышают чистоту ферментного препарата ионообменной хроматографией на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, фракционируют на колонке с сефадексом G-150, после очистки фермента осуществляют концентрирование на мембране Amicon РМ-30 до 5 см³ и направляют на лиофильную сушку при t=-30°C, после чего осуществляют иммобилизацию β-фруктофуранозидазы на полимерном волокнистом сорбенте (анионите), причем перед процессом иммобилизации сорбент обрабатывают 5%-ной соляной кислотой, дистиллированной водой, 5%-ным раствором едкого натра и снова водой, каждая обработка длится 12 ч, промытый сорбент дополнительно обрабатывают 95%-ным этиловым спиртом и снова водой, далее готовят водный раствор β-фруктофуранозидазы с содержанием 0,018-0,098 моль/дм³ и инкубируют подготовленный сорбент.