Способ получения сорбента для очистки дрожжевой гексокиназы Советский патент 1981 года по МПК C08B37/00 C12N9/00 C12N9/12 

- 1 .

Изобретение относится к энзимологии и. прелназначается для создания легкодоступного способа получения сор бента для очистки дрожжевой гексоккназы, используемой в качестве важного аналитического реактива для определения содержания адеиоэинтрифссфата, глюкозы и других гексоз в биологических жидкостях в медицинской и научной практике.

Для выделения и очистки дрожжевой гексокиназы известен ряд ионообменных сорбентов, среди которых наиболее часто используются ионообменные целлюлозы (КМ, ДЭАЭ, ТЭАЭ идр.), которые получают после ее соответствующей химической модификации fll .

Однако сорбенты данного типа обладают рядом существенных недостатков: низкой степенью селективности по отношению к определенному классу ферментов, низкой степенью очистки фермента, вследствие чего они приемпеюя, как правило, только в качестве составных стадий общих схем очистки фермента.

Более зффективным методом выделения и очистки ферментов является аффинная хроматография с использованием биоспецнфических сорбентов. Известны единичные случаи применения биоспецифических сорбентов для выделения и очистки дрожжевой гексокиназы 12) и З.

Однако сорбенты данного типа также обеспечивают лишь частичную очистку фермента и носят чисто научный характер.. Возможности практического применения сорбентов данного типа ограничены или полностью исключаются из-за дороговизны продуктов, используе1« х для синтеза сорбентов, сложности синтеза и низкой рабочей стабильности получаемых сорбентов.

Наибопее близким по технической сущности к предлагаемому является способ получения сорбента для очистки дрожжевой гексокиназы, который заключается в присоединении лигандач- (32Q -г1минопирндин)-адениндинуклеоТ1ша к полисахаридной матрице, в качестве которой используют 6-аминокапроилсефарозу, причем указанное взаимодействие проводят в присутствии водорастворимого гидрохлорида 1-этил-3-(3-ди- метиламинопропил)-карбодиимида при рЯ 4,75 в течение 24 ч 43.

Однако известный способ получения 30 сорбента для хроматографической очистки дрожжевой гексокиназы обладает рядом, существенных недостатков

Во-первых, исходная матрица, ис полЕ зуемая для получения сорбента является дорогостоящей, низкостабкльной к действию механических и химических факторов, вследствие чего ограничивается или полностью исключается возможность использования сорбентов, полученных на ее основе для препаративного выделения и очистки ферментов.

Во-вторых, испопьэуе.мыи в качестве лиганда сорбента (З-аминопиридин) адениндикуклеотид является труднодоступным и дорогостоящим веществом, обладакл2;(им недостаточной химической стабильностью, синтез его сложен и многостадиен, что в конечном счете ведет к дороговизне сорбента на его основе в целом и исключает возможность использования сорбента для практических целей с

В-тратьих, селективность сорбента по OTHODjeHHK) к дрожжевой гексокиназе является невысокой, ибо приводимый общий фактор очистки фер(.ента даже в пиковой фракции составляет 20 раз и приводит к получению првпарг та фермента с чистотой, с6ставляюи;ей 20%, при этом нет сведений о степени .сохранения актибности десорбированного фермента.

Цель изобретения - упрощение процесса получения сорбента для очистки дрожжевой гексокинаэы и повышение селективной сорбционной способности сорбента.

Поставленная цель достигается согласно способу получения сорбента для очистки дрожжевой гаксокнназы, заклю чакядемуся в присоедкнении лиганда к полисахарндной матрице фосфатцеллюлоэе путем обработки последней раствором, содержащим ионы хрома (i И) при мельком соотаошекии ионов хрома (if) и фосфатных остатков (0,):1 в 0,08-0,1 М ацетатном буферном растворе рН 5,4-5,8.

Обработку фосфатцеллюлоэы С г -содержащим раствором обычно осуществляют при постоянном перемешивании в течение 20-24 ч.

Концентрация ионов хрома (Mi) в сорбенте, полученном предлагаемым способом, составляет 200-800 мкМ/г сорбента.

При этом следует отметить, что при снижении концентрации ионов хрома () {ниже 200 мкМ/г сорбента) вплоть до его отсутствия в фосфатцеллюлоэе сорбция дрожжевой гексокиназы снижается до полного отсутствия сорбции на незаряженной иойами Сг фосФатцеллюлозе. С другой стороны, при Дсшьнеййкгм увеличении концентрации ионов хрома выше 800 мкМ/г сорбента происходит необратимая сорбция фермента.

.ПреиГ1 ществом предлагаемого способа является то,.что исключается .необходимость использования сложных химических превращений, дорогостоя1ЧИХ и труднодоступных веществ, упроJ. щается в целом методика получения сорбента. При этом, добавлением ионов хрома ((М) к легкодоступной фосфатцеллюлозе в матрицу вводится необходимое количество иона металла, являющегося эффективным сорбционным

центром связывания данного фермента, что приводит к повышению селективной сорбционной способности сорбента.

Для получения сорбента и его при енения для очистки дрожжевой гексо5 кинаэы используют следующую основную аппаратуру: лабораторная аппаратура для получения сорбента, хроматографические колонки, спектрофотометр СФ-16.

Q Материалы фосфатцеллюлоза(производства Олайнского завода химреактивов) с аналитической емкостью-0,71,1 мг-экв/г, С г, (SOj, ),j 6H,Q , янтарная кислота, уксусная кислота, натрий уксуснокислый, дрожжевая гексокиназа.

пример 1. Получение сорбента.

В круглодонную колбу, снабженную механической мешалкой, вводят 5,0 г сульфата хрома ( М ) С гг ( SOi, )з, ,

800 мл ОД М ацетатного буферного раствора рН 5,6 и 10,0 г фосфатцеллюлозы (ОЗХР). Содержимое колбы перемешивают в течение 20-24 ч. По окончании реакции сорбент отфилт тровывают, промывают водой 0,1 М раствором янтарной кислоты для удаления избыточного хрома { И t ).

Концентраций) ионов хрома ( I М ) в сорбенте определяют из разницы его

концентраций в начальном растворе и растворе после зарядки фосфатцеллюлозы спектрофотометрически с этилендиаминотетрауксусной кислотой (ЭДТА) при 525 нм.

П р и М а р 2. Очистка дрожжевой

гексокйназы.

а) 2,0 г комплекса фосфатцелллюлоэы с ионами хрома (Ml) загружают в

хроматографическую колонку (1 к 20 см) уравновешивают 5 мМ сукцннатным буферным раствором рН 6,0, содержащим 0,5 ЭДТА и наносят 4,0 мм ферментного раствора дрожжевсШ гексокиназы

фирмы Флука (Ывейдария). Концентраиля белка 1,45 мг/мл, удельная активность 28,0 ед/мг белка. При элюции 330 мл исходного буферного раствора рН 6,0 выивлваются балластные белки. Элюирование активной гексокиназы проводят градиентом х.лористого натрия от 0,005 М до 0,25 М в сукцинатном буферном растворе рН 6,0. Удельная активность гексокиназы после десорбцйи 300 ед/мг белка. Выход по активности 90%. б) 2,0 г сорбента загружают в хр матографическую колонку (1 х 20 см) уравновешивают 5 мМ сукцинатным буферным раствором рН 6,0, содержащим 0,5 мМ ЭДТА, и наносят 5,О мл ферментного препарата, полученного пос ле двухчасового автолиза при З7с тю ттПЧ/vu ГГма/ ГО а а 3 суспензии 1,8 г. пекарских дрожжей в 5 мл 0,2 М , с 0,5 мМ ЭДТА и последующего диализа против исходно го буферного раствора рН 6,0. Конце трация белка составляет 9,6 мг/мп, удельная активность 4,б ед/мг белка При элюции 340 мл сукцинатного буфе ного раствора рН 6,0 вьп.илвагатся бал ластные белки. Элюирование гексокин зы проводят градиентом хлористого н эия от 0,005 до 0,5 М в исходном бу ферном растворе рН 6,0. Удельная ак тивность гексокиназы после десорбци 42 ед/мг белка. Выход по активности 61%. в) в хроматографическую колон.ку, заполненную сорбентом-как в примере 2 (а и б), уравнове иенную 50 мМ боратньпу буферным раствором рН 7,6, содержащим 0,5 мМ ЭДТА, наносят 3,5 мл базового препарата дрожжевой гексокиназы, полученного после автолиза 1,6 г высушенных пекарских дрож жей в течение 2 ч при 37С в 5 мл 042 М Na,HPOiH хроматографической очистки на колонке с ДЭДЭ-цеЛлюлозой Концентрация белка 0,98 мг/мп, удель ная активность 33 ёд/мг белка. При элюции 200 мл боратного буферного раствора рН 7,6 вымываются балластные белки. Активная гексокиназа элюируется при повышении концентрации янтарной кислоты от 0,001 до 0,05 М в исходном боратном буферном растворе рН 7,6. Удельная активность гексокиназы 300 ед/м1 белка. Bbaxi, д по активности не ниже 50%. г) в хроматографическую колонку как в примере 2 в,, уравновешенную 50 боратным буферным раствором рН 7,6, наносят 3,5 мл ферментного препарата гексокиназы фирмы Флука (Швейцария). Концентрация белка 2,0 мг/мл, удельная активность 31 ед/мг белка. При элюции 50 мл исходного буферного раствора рН 7,6 вымываются балластные белки. Активная гексокиназа десорбируется грещиентом янтарной кислоты от 1 мМ до 50 мМ в исходном буферном растворе 7,6. Удельная активность десорбироваиного фермента составляет 990 Е/мг белка с выходом по активности 75%. ПримерЗ. 2г сорбента (кон центрация ионов хрома (III) 200 мкМ/г сорбента) загружают в хроматографическую колонку (1 X 20 см) уравновешивают 50 мМ боратным-буфером рН 7,6 срдержай1им 0,5 мМ ЭДТА, и наносят 3 мл фермейтного раствора дрожжевой гекоокинаэы. 5 полученного после автолиза 1,5 г высушенных пекарских дрожжей в течение 2 ч при 37°С в 5 мл 0,2 М , и обессоливании на сефадексе У-25. Концентрация белка 0,98 мг/мп, удельная активность 33 ед/мг. При элюции 170мл iv.-.... л.пл. t,,jL--: исходного буферного раствора вымываются балластные белки. Активная гексокинаэа алюируется при повышении концентрации янтарной кислоты от 0,001 до 0,05 М в боратном буферном растворе рН 7,6 с 0,5 мМ ЭДТА. Удельная активность гексокиназы 211 ед/мг. Выход по активности 45%. Примера. 2г сорбента (концентрация ионов хрома (III) 800 мкМ/г сорбента) загружают в хроматографичёскую колонку(1 х 20 см), уравновешивают 50 мМ боратным буферным раствором рН 7,6, содержащим 0,5 мМ ЭДГГА, и наносят 8 мл ферментного раствора, полученного после автолиза 2,8 г пекарских дрожжей в течение 2 ч при вЮ мл 0,2 М , хроматографической очистки на колонке с ДЭАЭ-.. целлюлозой и обессоливания на сефадексе У-25. Концентрация белка ферментного препарата 1,3 мг/мп, удельная активность 10,4 ед/мг. При элюировании 850 мл исходного буферного раствора вымываются балластные белки Активная гексокиназа элюируется при повь&иеник концентрации янтарной кислоты от 0,001 до 0,1 М в боратном буфере рН 7,6 с 0,5 мМ ЭДТА. Удельная активность гексокиназы 90,4 ед/мг. Выход по активности 32%. Предлагаемый способ получения сорбента на основе полисахарида - фосфатцеллкиюэы путем ее зарядки ионами хрома (lit) обеспечивает, по сравне нша с изаестмыми способгьми получения сорбентов для очистки дрожжевой гексокиназы, дешевизну, доступность исходных вецеств необходимых для получения сорбента, простоту и доступность метода получения сорбена :в неограинченном количестве, высокую эффективность сорбента по отношению дрожжевой гексокиназы, сравнимую с лучши1« oOpaaitaMt зарубежных аналогов, т. е. повышение удельной активности фермента за одну операцию сорбции - десорбции в среднем в 10-15 раз с сохранением активности десорбированного фермента на 50-90%. Формула изобретения 1. Способ получения сорбента для чистки дроясжевоЯ гексокиназы путем рисоединения лиганда к полисахаридой матрице, отличающийя тем, ЧТО с целью упрощения роцесса и повьяоения селективной сорбионной способности сорбента, в каестве полисахаридной матрицы испольэуют фосфатцеллюлозу, присоединение 785714 лиганда к матрице проводят путем обраОртки посутедней раствором, содержаошм ионы хрома (I I I) при мольном соотношении ионов хрома (III) и фосфатных остатков (0,25-2) : 1 в 0,080,1. М ацетатном буферном растворе рН5,4-5,8. 2. Способ по п.1,от л и ч а юЦ и Й с я тем, что обработку фосфат целлюлозы С rt -содержащим раствором осуществляют при постоянном пёрег ши-щ вании в течение 20-24 ч.Ю Источники информёщии принятые во внимание при экспертизе 1. Womach F. С., Welch М. К., MIelsenfi, Colowich S. P., Очистка и 58 феррологическое сравнение изоферг-дантов дрожжевой гексокинаэы Р-1 и Р-П, Arch. Biochem, Btophys. 158, 1973, с. 451-457. 2. Lee С, Y., Lagarus L. Н., Каbakoff D. S., Russel Р.В. , Laver Ог.М. Kaplan N. 0. Purification of Kinases by General LIgahd Affinity Chromatography, Archives of Biochem. Biophys, 178,(197,7) 8 (прототип) з. Wright С. L., Warsy А. S., Но1rayde И. G ., Тгауег G . Р., BJochem G., 175 (1978), 125. . 4. Каренман И. М. Фотометрический анализ. М., Химия, 1975, с. 260.