Способ очистки дрожжевой гексокиназы Советский патент 1981 года по МПК C12N9/00 C12N9/12 C12N1/16 

(54) СПОСОБ ОЧИСТКИ ДРОЖЖЕВОЙ ГЕКСОКИНАЗЙ

Изобретение относится к области препаративной энзимологии, а именно к способам очистки дрожжевой гексокиназы, которая используется в качестве аналитического реактива для определения содер йания гексоз и аден зинтрифосфата в биологических жилкостях в медицинской практике. Препараты дрожжевой гексокиназы широко используются в различных областях науки. . Наряду с классическими методами выделения и очистки дрожжевой гексо киназы, являющимися трудоемкими и многостадийными, известны -единичные случаи применения методики биоспе-. цифической хроматографии Г1 . Однако известные способы очислгки основанные на биоспецифической хроматографии, в большей степени демон стрируют принципиальную возможность создания биоспецифических сорбентов дрожжевой гексокиназы, ибо практические возможности использования аф финных сорбентов для очистки данног фермента сильно затруднены из-за сложности и дороговизны их синтеза и низкой рабочей стабильности. Известен также способ очистки дрожжевой гексокиназы, включающий обработку дрожжевого экстракта 0,1М раствором (NH4),SOj , выдерживание смеси в течение 16 ч с последующим центрифугированием, пропусканием полученного экстракта через колонку с сефадексом Г-25, вымыванием,фермента буферным раствором 10 мМ малеиновой кислоты - NaOH с последующим пропусканием элюата фермента поочередно через колонки с дуолитом А-2, КМ-целлк лозо и фосфорилметилцеллюлозой, прибавлением к элюату 0,05-кратного количества 1М триэтаноламин-НС1 буферного раствора (рН 7,5) , подщелачивания 5 N NaOH до рН 7,5 с последующим пропусканием элюата через колонку с ДЭАЭ-целлюлозной, десорбции фермента 150 мМ триэтаноламин-НС1 буферным раствором (рН )и выделением из элюата фермента Г2 .Однако процесс очистки фермента является многостадийным и трудоемким, включающим многократные операции хроматографии через целый ряд ионообменных материалов различного типа.. Основой известного способа очистки фермента является использование в качестве сорбента водонерастворимых производных фосфорной кислоты, фосфат или фосфорилметилцеллюлоэ. Однако дрожжевая гексокиназа на данном сорбенте практически не задерживается как это подтверждено данными способа 3 .

Кроме того, выход очищенного фермента после всех стадий его выделения и очистки является крайне низким так как из 10,0 кг дрожжей получают лишь 0,2 фермента с удельной активностью 300-330 ед/мг белка. Этот фактор, наряду с трудоемкостью всей схемы очистки фер 1ента, сказывается на дороговизне получаемого фермента.

Цель изобретения - упрощение процесса очистки фермента, сок)ащение его продолжительности и повышение выхода фермента.

Поставленная цель достигается пу-. тем хроматографии ферМентсодержащего раствора на сорбенте, представляющем собой комплекс фосфатцеллюлозы с ионами Сг с концентрацией последних 200-800 мкМ/г сорбента, причем сорбцию проводят с помощью 4-6 мМ сукцинатного буферного раствора с рН 5,8-6,0 или 25-50 мМ боратного буферного раствора с рН 1,5-1 ,11 содержащих О,Г-0,5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), а десорбцию проводят соответственно градиентом хлористого натрия от 0,001-0,005 до 0,45-0,5 М в исходном сукционатно буфере или градиентом янтарной кислоты от 0,01-0,05 М до 0,045-0,05 М в исходном боратном буферном растворе.

В качестве ферментосодержащего раствора обычно используют автолизат высушенных пекарских дрожжей, или препарат фермента, полученный после автолиза пекарских дрожжей и фракционирования сульфатом аммония, или препарат фермента, полученный после автолиза дрожжей и хроматографии через ДЭАЭ-целлюлозу.Существенными отличиями способа являю5гся условия хроматографии фермета: природа я характеристики используемого сорбента, природа буферных растворов.

Преимущества предлагаемого способа заключаются в том, что вместо мноroKpafHoro поочередного хроматографирования на различных типах сорбентов проводят один цикл хроматографической очистки, что значительно упрощает процесс очистки, сокращает его продолжительность и, кроме того, приводит к повыщению выхода фермента.

Механизм сорбционной очистки, лежащий в основе предлагаемого способа основан на том, что ионы , вводимые в фосфатцеллюлозу, являются эффективными сорбционными центрами фермента, способствующими достаточно .селективному его удерживанию, что выражается в эффективной очистке

препаратов гексокиназы, включая начальные дрожжевые автолизаты и базовые препараты фермента. Степень очистки фермента за один хроматографический цикл составляет в среднем 10-15 раз с выходом активного фермента 50-90%.

Для осуществления способа очистки дрожжевой гексокиназы используют лабораторную аппаратуру для получения сорбента, хроматографические колонки, спектрофотометр СФ-16, комплектную хроматографическую аппаратуру.

В качестве материалов используют фосфатцеллюлозу (производства Олайнского завода химреактивов с аналитической емкостью 0,7-1,1 мг-экв/г ДЭАЭ и фосфатцеллюлозу фирмы Ватман (Великобритания), прессованные пекарские дрожжи ГОСТ 171-69 производства Паневежеского опытного спиртового завода, базовый препарат дрожжевой . гексокиназы удельной активностью 30-40 ед/мг фирмы Флука (Швей.цария) , С г 2(С04 )j6H rjiO , янтарную, уксусную и борную кислоты, натрий уксуснокислый, натрий тетраборнокислый и натрий хлористый.

Пример. Получение сорбента. В круглодонную колбу, снабженную механической мешалкой, вводят 5,0 г сульфата хрома (ЧП CTQ (S0)jx xGHijO 800 мл 0,1 М ацетатного буферного раствора рН 5,6 и 10,0 г фосфатцеллюлозы (ОЗХР). Содержимое , колбы перемешивают в течение 20-24 ч По окончании реакции сорбент отфильтровывают, промывают водой, 0,1 М раствором янтарной кислоты для удаления избыточного хрома (Ш) .

Концентрацию ионов хрома (НО в сорбенте определяют из разницы его концентраций в начальном -растворе и растворе после зарядки фосфатцеллюлозы спектрофотометрически с этилендиаминотетрауксусной кислотой §ДТА при 525 нм Г4.

П р и М е р 2. Очистка дрожжевой гексокиназы .

а) 2,0 г комплекса фосфатцеллюлозы с «ионами хрома (1111 загружают в хроматографическую колонку (1x20 см), уравновешивают 5 мМ сукцинатным буферным раствором рН 6,0, содержащим 0,5 ММ ЭДТА и наносят 4,0 мг ферментного раствора дрожжевой гексокиназы Фирмы Флука. Концентрация белка 1,45 мг/мл, удельная активность 28,0 ед/мг белка. При элюции 330 мл исходного буферного раствора рН 6,0 вымываются балластные белки. Элюирование активной гексокиназы проводят градиентом хлористого натрия от 0,005 до 0,25 М в сукциг натном буферном растворе рН 6,0. Удельная активность гексокиназы после десорбции 300 ёд/мг белка. Выход по активности 90%.