ПЛОТНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ Российский патент 2008 года по МПК C12N1/20 C12R1/32 

Изобретение относится к микробиологическим исследованиям, касается питательной среды для культивирования микобактерий и может быть использовано для характеристики микобактерий по их биологической активности.

Известны плотные питательные среды для выращивания первичных культур микобактерий, состоящие из яичной массы и солевой основы: Левенштейна-Йенсена, Гельберга, Петраньяни, среды Финн-2 и Мордовского /1/. Технология изготовления этих сред предусматривает их свертывание, что исключает возможность их использования в качестве компонента двухслойной среды для изучения биологической активности микобактерий.

Цель изобретения - плотная питательная среда для культивирования микобактерий, пригодная для использования в качестве наслаиваемого компонента двухслойных сред.

Поставленная цель достигается тем, что питательная среда, содержащая солевую основу и яичную основу, содержит в качестве солевой основы L-аспарагин, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит и дистиллированную воду, а в качестве яичной основы - водный раствор желтка куриного яйца (1:1) при следующем соотношении компонентов:

L-аспарагин4,0 гкадий фосфорнокислый двузамещенный0,5 гсернокислый магний0,5 глимонная кислота2,0 глимоннокислое аммиачное железо0,05 гпируват натрия0,5 гглицерин40,0 гагар30,0 ггумивит90,0-95,0 млводный раствор желтка куриного яйца (1:1)250,0 млдистиллированная водадо 1000,0 мл

Гумивит - щелочной гидролизат низинных сортов торфа (выпускается ООО "Агропром") представляет собой высокодисперсный золь натриевых солей комплекса гумусных кислот - гуминовых, гуматомелановых и фульвокислот /2/. Раствор солей гумусных кислот состоит из длинных фрагментарных цепочек с различными функциональными группами, важнейшими из которых являются карбоксильные (СООН) и фенольные (ОН), способные образовывать хелатные комплексы с микроэлементами, что обеспечивает их высокую обменную емкость и транспорт в клетку микроорганизмов /3, 4/. Гумивит - жидкость темно-коричневого до черного цвета со специфическим сладковатым запахом, благодаря чему готовая среда имеет интенсивно коричневый цвет, на фоне которого хорошо видны даже мелкие колонии в начальной фазе роста.

Сущность способа поясняется примерами.

Пример 1. Для приготовления среды в химически чистую стерильную колбу емкостью 2,0 л наливали 300,0 мл дистиллированной воды, прогревали на водяной бане до 75-85°С. В воде растворяли последовательно 2,0 г лимонной кислоты, 4,0 г L-аспарагина, 0,5 г сернокислого магния, 0,5 г двузамещенного фосфорнокислого калия, 0,05 г лимоннокислого аммиачного железа, 0,5 г пирувата натрия, 40,0 г глицерина, 90,0 мл гумивита и 30,0 г агара. Каждый компонент добавляли после полного растворения предыдущего. После внесения всех компонентов общий объем доводили до, 750,0 мл стерильной дистиллированной водой. Устанавливали рН 7,1-7,2 добавлением 1 н. NaOH или 1 н. HCl. Раствор автоклавировали в течение 30 минут при 1 атм. Свежие куриные яйца хорошо промывали в проточной воде, протирали 96° этиловым спиртом, разбивали в стерильных условиях и отделяли белок от желтка. В стерильной колбе смешивали желток и дистиллированную воду в соотношении 1:1 и 250,0 мл полученного раствора,_{добавляли в расплавленную агаровую среду, перемешивали, разливали по пробиркам по 3,0 мл и скашивали.}

Пример 2. В таблице 1 приведены варианты плотной питательной среды в соответствии с изобретением.

Таблица 1Состав разных вариантов плотных питательных средСоставВариант новой среды 1-й2-й3-й4-йL-аспарагин, г4,04,04,04,0Калий фосфорнокислый двузамещенный, г0,50,50,50,5Сернокислый магний, г0,50,50,50,5Лимонная кислота, г2,02,02,02,0Лимоннокислое аммиачное железо, г0,050,050,050,05Пируват натрия, г0,50,50,50,5Глицерин, г40,040,040,040,0Агар, г30,030,030,030,0Гумивит, мл85,090,095,0100,0Водный раствор желтка куриного яйца (1:1), мл250,0250,050,0250,0Дистиллированная вода, млдо 1000,0до 1000,0до 1000,0до 1000,0

Пример 3. Для определения эффективности плотной питательной среды для культивирования микобактерий использовали референс-штаммы микобактерий M.bovis (шт.Vallee и BCG), M.tuberculosis (шт.Academia, H₃₇Ra), M.avium (шт.ГИСК, 44, 659), M.smegmatis (шт.53), M.phlei. Все штаммы хранились на среде Левенштейна-Йенсена в холодильнике при температуре +4°С. Посевы культур производили нанесением одной капли суспензии микобактерий, содержавшей 30-60 КОЕ при посеве на среду Левенштейна-Йенсена и на все сравниваемые варианты среды в соответствии с изобретением. Посев каждого штамма проводили на 3-5 пробирок. При оценке роста культур учитывали сроки появления первичных колоний, интенсивность роста (± слабый, + средний, ++ обильный) и изучали культурально-морфологические свойства. Контроль - плотная питательная среда Левенштейна-Йенсена. Полученные результаты (таблицы 2 и 3) показали, что оптимальными являются варианты 2 и 3 плотной питательной среды в соответствии с изобретением, обеспечивавшие более ранние сроки появления первичных колоний и более высокую интенсивность роста, относительно варианта 1 и сравнимые с таковыми на среде Левенштейна-Йенсена. Повышение количества гумивита (вариант 4 плотной питательной среды в соответствии с изобретением) не сокращало сроки появления роста и не повышало его интенсивность, поэтому было нецелесообразным. Культурально-морфологические свойства и цвет выросших колоний штаммов не отличались от таковых на исходной среде.

Таблица 2Сроки появления первичного роста микобактерий на средах разных вариантовШтаммыСроки появления роста, днейСреда в соответствии с изобретениемСреда Левенштейна - ЙенсенаВариант 1Вариант 2Вариант 3Вариант 4M.bovis (шт.Vallee)1513121214M.bovis (шт.BCG)1515151515M.tuberculosis (шт.Academia)131110109M.tuberculosis (шт.H₃₇Ra)131110109M.avium (шт.ГИСК)97777M.avium (шт.44)1210997M.avium (шт.659)111010108M.phlei43222M.smegmatis (шт.53)43222

Таблица 3 Массивность роста микобактерий на средах разных вариантовСредаШтаммы микобактерийM.bovis ValleeM.bovis BCGM.tub. AcademiaM.tub. H₃₇RaМ.avium ГИСКМ.avium 44М.avium 659М.phleiM.smegmatis 53Массивность роста3 недели роста1 неделя ростаВариант 1±±±+±±±++Вариант 2++++++++++++Вариант 3++++++++++++++Вариант 4++++++++++++++Среда Левенштейна Йенсена++++++++++++++

Пример 4. В таблице 4 приведены результаты исследования антагонистической активности пробиотика «Колибактерин» по отношению к микобактериям с использованием среды в соответствии с изобретением, которую наслаивали на засеянный пробиотическими штаммами мясопептонный агар.

Таблица 4Антагонистическая активность пробиотика «Колибактерин» по отношению к микобактериямДоза колибактерина, КОЕ/мл суспензии, при засеве 10 мклИнтенсивность ростаM.tuberculos is Н₃₇RaM.tuberculos is AcademiaM.bovis ValleeМ. avium 44M.smegmatis 531-5×10³+++++1-5×10⁴+++++1-5×10⁵±±±±+1-5×10⁶±±±-+1-5×10⁷±---+1-5×10⁸----±Примечание: + средний рост, ± слабый рост, - отсутствие роста

Проведенные исследования подтвердили эффективность плотной питательной среды в соответствии с изобретением для культивирования микобактерий (сроки появления первичного роста и интенсивность роста сравнимы с таковыми на традиционно применяемых средах). Обратимость среды позволяет использовать ее в качестве наслаиваемого компонента двухслойной питательной среды при изучении биологических свойств микобактерий. Заявленная плотная питательная среда отличается дешевизной и технологичностью приготовления, а ее использование упрощает проведение бактериологических исследований благодаря визуализации начального роста колоний.

Источники информации

1. Васильев В.Н. Микобактериозы и микозы легких. - София, 1971. - С.146-175.

2. Гришин Г.И., Слинина К.Н. Дар природы - гумивит.//Практик. - 2004. - №3-4. - С.80-82.

3. Левинский Б.В. Все о гуматах. - Иркутск: ИП Марков С.Е., 1999. - 198 с.

4. Сорокина Н.Ф. Физиология активности продуктов окисления торфа.//Новые процессы и продукты переработки торфа. - Минск: Наука, 1982. - С.109-115.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для исследования микобактерий туберкулеза. Питательная среда содержит калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, L-аспарагин, глицерин, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, дистиллированную воду, пируват натрия, агар, гумивит и водный раствор желтка куриного яйца (1:1). Изобретение позволяет удешевить питательную среду и упростить бактериологические исследования. 4 табл.

Плотная питательная среда для культивирования микобактерий, содержащая солевую и яичную основу, отличающаяся тем, что она содержит в качестве солевой основы L-аспарагин, калий фосфорно-кислый двузамещенный, серно-кислый магний, лимонную кислоту, лимонно-кислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит и дистиллированную воду, а в качестве яичной основы - водный раствор желтка куриного яйца (1:1) при следующем соотношении компонентов:

L-аспарагин4,0 гдвузамещенный фосфорно-кислый калий0,5 гсерно-кислый магний0,5 глимонная кислота2,0 глимонно-кислое аммиачное железо0,05 гпируват натрия0,5 гглицерин40,0 гагар30,0 ггумивит90,0-95,0 млводный раствор желтка куриного яйца (1:1)250,0 млдистиллированная водадо 1000,0 мл