ПЛОТНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПАТОГЕННЫХ МИКОБАКТЕРИЙ И НОКАРДИОФОРМНЫХ АКТИНОМИЦЕТОВ Российский патент 2009 года по МПК C12N1/20 C12R1/04 

Изобретение относится к микробиологическим исследованиям, касается питательной среды для культивирования микобактерий и нокардиоформных актиномицетов и может быть использовано для характеристики микобактерий по их биологической активности.

Известны плотные питательные среды для выращивания первичных культур микобактерий, состоящие из яичной массы и солевой основы: Левенштейна-Йенсена, Гельберга, Петраньяни, среды Финн-2 и Мордовского /1/. Приготовленные по прописям яичные среды разливают по пробиркам по 4-5 мл, помещают в аппарат для свертывания или в аппарат Коха в наклонном положении и стерилизуют при 85°С в течение 2 дней по 40 минут или однократно при 90°С в течение 1 часа.

Цель изобретения - плотная питательная среда для культивирования микобактерий и нокардиоформных актиномицетов, простая в получении и использовании.

Поставленная цель достигается тем, что питательная среда, содержащая солевую основу и яичную основу, содержит в качестве солевой основы L-аспарагин, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит и дистиллированную воду, а в качестве яичной основы сваренный вкрутую желток куриного яйца при следующем соотношении компонентов:

L-аспарагин 4,0 г калий фосфорнокислый двузамещенный 0,5 г сернокислый магний 0,5 г лимонная кислота 2,0 г лимоннокислое аммиачное железо 0,05 г пируват натрия 0,5 г глицерин 40,0 г агар 15,0 г гумивит 90,0-95,0 мл сваренный желток куриного яйца 250,0 г дистиллированная вода до 1000,0 мл

Гумивит - щелочной гидролизат низинных сортов торфа (выпускается ООО Агропром), представляет собой высокодисперсный золь натриевых солей комплекса гумусных кислот - гуминовых, гуматомелановых и фульво-кислот 121. Раствор солей гумусных кислот состоит из длинных фрагментарных цепочек с различными функциональными группами, важнейшими из которых являются карбоксильные (СООН) и фенольные (ОН), способные образовывать хелатные комплексы с микроэлементами, что обеспечивает их высокую обменную емкость и транспорт в клетку микроорганизмов /3, 4/. Гумивит - жидкость от темно-коричневого до черного цвета со специфическим сладковатым запахом, благодаря чему готовая среда имеет интенсивно коричневый цвет, на фоне которого хорошо видны даже мелкие колонии в начальной фазе роста.

Сущность способа поясняется примерами.

Пример 1. Для приготовления среды в химически чистую стерильную колбу емкостью 2,0 л наливали 300,0 мл дистиллированной воды, прогревали на водяной бане до 75-85°С. В воде растворяли последовательно 2,0 г лимонной кислоты, 4,0 г L-аспарагина, 0,5 г сернокислого магния, 0,5 г двузамещенного фосфорнокислого калия, 0,05 г лимоннокислого аммиачного железа, 0,5 г пирувата натрия, 40,0 г глицерина и 90,0 мл гумивита. Каждый компонент добавляли после полного растворения предыдущего. После внесения всех компонентов общий объем доводили до 750,0 мл стерильной дистиллированной водой. Устанавливали pH=7,1-7,2 добавлением 1 н. NaOH или 1 н. HCl. Свежие куриные яйца хорошо промывали в проточной воде, отваривали вкрутую, извлекали желтки. Расчетное количество сваренного вкрутую желтка (250 г) растирали в ступке в полученном солевом растворе до получения однородной массы, в которую добавляли 15 г агара, перемешивали, доводили объем до 1000 мл и нагревали на водяной бане до расплавления агара. Полученную среду автоклавировали в течение 30 минут при 1 атм. Приготовленную питательную среду хранили в холодильнике при температуре +4°С и использовали по мере надобности, для чего ее расплавляли, разливали по пробиркам и сквашивали.

Пример 2. В таблице 1 приведены варианты плотной питательной среды в соответствии с изобретением.

Таблица 1 Состав разных вариантов плотных питательных сред Состав Вариант новой среды 1-й 2-й 3-й 4-й L-аспарагин, г 4,0 4,0 4,0 4,0 Калий фосфорнокислый двузамещенный, г 0,5 0,5 0,5 0,5 Сернокислый магний, г 0,5 0,5 0,5 0,5 Лимонная кислота, г 2,0 2,0 2,0 2,0 Лимоннокислое аммиачное железо, г 0,05 0,05 0,05 0,05 Пируват натрия, г 0,5 0,5 0,5 0,5 Глицерин, г 40,0 40,0 40,0 40,0 Агар, г 15,0 15,0 15,0 15,0 Гумивит, мл 85,0 90,0 95,0 100,0 Сваренный вкрутую желток куриного яйца, г 50,0 250,0 250,0 250,0 Дистиллированная вода, мл до 1000,0 до 1000,0 до 1000,0 до 1000,0

Пример 3. Для определения эффективности плотной питательной среды для культивирования микобактерий использовали референс-штаммы микобактерий M.bovis (шт.Vallee и BCG), M.tuberculosis (шт. Academia) и M.avium (шт. ГИСК, 44, 659). Все штаммы хранились на среде Левенштейна-Йенсена в холодильнике при температуре +4°С. Посевы культур производили нанесением одной капли суспензии микобактерий, содержавшей 30-60КОЕ при посеве на среду Левенштейна-Йенсена, и на все сравниваемые варианты среды в соответствии с изобретением. Посев каждого штамма проводили на 3-5 пробирок. При оценке роста культур учитывали сроки появления первичных колоний, интенсивность роста (± слабый, + средний, ++ обильный) и изучали культурально-морфологические свойства. Контроль - плотная питательная среда Левенштейна-Йенсена. Полученные результаты (таблицы 2 и 3) показали, что оптимальными являются варианты 2 и 3 плотной питательной среды в соответствии с изобретением, обеспечивавшие более ранние сроки появления первичных колоний и более высокую интенсивность роста относительно варианта 1 и сравнимые с таковыми на среде Левенштейна-Йенсена. Повышение количества гумивита (вариант 4 плотной питательной среды в соответствии с изобретением) не сокращало сроки появления роста и не повышало его интенсивность, поэтому было нецелесообразным. Культурально-морфологические свойства и цвет выросших колоний штаммов не отличались от таковых на исходной среде.

Таблица 2 Сроки появления первичного роста патогенных микобактерий на средах разных вариантов Штаммы Сроки появления роста, сут Среда в соответствии с изобретением Среда Левенштейна-Йенсена Вариант 1 Вариант 2 Вариант 3 Вариант 4 M.bovis (шт. Vallee) 15 13 12 12 14 M.bovis (шт. BCG) 15 15 15 15 15 M.tuberculosis (шт. Academia) 15 11 10 10 10 M.avium (шт. ГИСК) 9 7 7 7 7 M.avium (шт. 44) 12 10 9 9 7 M.avium (шт. 659) 11 10 10 10 8

Таблица 3 Массивность роста патогенных микобактерий на средах разных вариантов Среда Штаммы микобактерий M.bovis Vallee M.bovis BCG M.tub. H₃₇Ra M.tub. Acad. M.avium ГИСК M.avium 44 M.avium 659 Массивность роста 3 недели роста в соответствии с изобретением Вариант 1 ± ± + ± ± ± ± Вариант 2 + + ++ + + + + Вариант 3 + + ++ + ++ + ++ Вариант 4 + + ++ + ++ + ++ Среда Левенштейна-Йенсена + + ++ + ++ + ++

Пример 4. Для определения эффективности среды для культивирования нокардиоформных актиномицетов использовали референс-штамм Corynebacterium pseudotuberculosis и четыре штамма родококков, выделенные от свиней и идентифицированные в лабораторных условиях. Все штаммы хранились на среде Левенштейна-Йенсена в холодильнике при температуре +4°С. Посевы культур и учет результатов проводили, как в примере 3. Контроль - традиционно применяемая среда Левенштейна-Иенсена. Результаты представлены в таблицах 4 и 5.

Таблица 4 Сроки появления первичного роста нокардиоформных актиномицетов на средах разных вариантов Штаммы Сроки появления роста, сут Среда в соответствии с изобретением Среда Левенштейна-Иенсена Вариант 1 Вариант 2 Вариант 3 Вариант 4 Rhodococcus equi, шт.12 3 2 2 2 2 Rhodococcus equi, шт.13 4 2 2 2 2 Rhodococcus equi, шт.5 3 2 2 2 2 Rhodococcus equi, шт.6 3 3 2 2 2 Corynebacterium pseudotuberculosis 3 2 2 2 2

Таблица 5: Массивность роста нокардиоформных актиномицетов на средах разных вариантов Среда Штаммы нокардиоформных актиномицетов Rhodococcu sequi 12 Rhodococcu sequi 13 Rhodococcu
sequi 14 Rhodococcus equi 15 Corynebacterium pseudotuberculosis Массивность роста в соответствии с изобретением Вариант 1 ± + + + ± Вариант 2 + ++ ++ ++ + Вариант 3 ++ ++ ++ ++ + Вариант 4 ++ ++ ++ ++ + Среда Левенштейна-Йенсена ++ ++ ++ ++ +

Пример 5. Для сравнительного изучения информативности среды в соответствии с изобретением (вариант 2) и сред Левенштейна-Йенсена, Финн-2, Гельберга, ФАСТ-3Л и Петраньяни использовали референс-штаммы микобактерий M.bovis (шт. Vallee, Ravenal, БЦЖ), М.avium (шт. ГИСК и 659), полевые штаммы, выделенные от положительно реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота неблагополучных по туберкулезу хозяйств с характерными поражениями в органах и лимфатических узлах и клинические штаммы M.tuberculosis, выделенные от больных туберкулезом. Все штаммы хранились на среде Левенштейна-Йенсена в холодильнике при температуре +4°С. Посевы культур производили нанесением одной капли суспензии микобактерий, содержавшей 30-60 КОЕ при посеве на известные среды и на среду в соответствии с изобретением. Посев каждого штамма проводили на 3-5 пробирок. При оценке роста культур учитывали сроки появления первичных колоний и изучали культурально-морфологические свойства. Интенсивность роста изучали при посеве культуры М.bovis (шт.Vallee) на все анализируемые среды. Результаты представлены в таблицах 6 и 7.

Таблица 7 Интенсивность роста М.bovis (шт.Vallee) на плотных питательных средах Питательная среда Сутки 7 9 10 11 12 13 14 15 16 24 Левенштейна-Йенсена - - - - - + + ++ ++ +++ Финн-2 - - - - - + + ++ ++ +++ Гельберга - - - - - - ++ ++ ++ +++ ФАСТ-ЗЛ - - - - - - + ++ +++ +++ Петраньяни - - = = - - + ++ +++ +++ Заявленная среда - - - + ++ ++ ++ +++ +++ ++++ Примечание: + - единичные колонии; ++ - 10-20 колоний: +++ - 21-50 колоний; ++++ - сплошной рост

Проведенные исследования подтвердили эффективность плотной питательной среды в соответствии с изобретением для культивирования микобактерий и нокардиоформных актиномецитов (сроки появления первичного роста и интенсивность роста сравнимы с таковыми на традиционно применяемых средах). Обратимость среды позволяет использовать ее в качестве наслаиваемого компонента двухслойной питательной среды при изучении биологических свойств микобактерий.

Заявляемая плотная питательная среда отличается дешевизной и технологичностью приготовления, а ее использование упрощает проведение бактериологических исследований благодаря визуализации начального роста колоний.

Источники информации

1. Васильев В.Н. Микобактериозы и микозы легких. - София, 1971. - С.146-175.

2. Гришин Г.И., Слинина К.Н. Дар природы - гумивит // Практик. - 2004. - №3-4. - С.80-82.

3. Левинский Б.В. Все о гуматах. - Иркутск: ИП Марков С.Е., 1999. - 198 с.

4. Сорокина Н.Ф. Физиология активности продуктов окисления торфа // Новые процессы и продукты переработки торфа. - Минск: Наука, 1982. - С.109-115.

Плотная питательная среда содержит в качестве солевой основы L-аспарагин - 4,0 г, калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,5 г, сернокислый магний - 0,5 г, лимонную кислоту - 2,0 г, лимоннокислое аммиачное железо - 0,05 г, пируват натрия - 0,5 г, глицерин - 40,0 г, агар - 15,0 г, гумивит - 90,0-95,0 мл. В качестве яичной основы она содержит сваренный вкрутую желток куриного яйца - 50,0 г и дистиллированную воду до 1000,0 мл. Это обеспечивает сроки появления первичного роста и интенсивность роста, сравнимые с таковыми на традиционно применяемых средах, дешевизну и технологичность приготовления, а ее использование упрощает проведение бактериологических исследований. 7 табл.

Плотная питательная среда для культивирования патогенных микобактерий и нокардиоформных актиномицетов, содержащая солевую и яичную основы, отличающаяся тем, что она содержит в качестве солевой основы L-аспарагин, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимонно-кислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит и дистиллированную воду, а в качестве яичной основы - сваренный вкрутую желток куриного яйца при следующем соотношении компонентов:
L-аспарагин 4,0 г калий фосфорнокислый двузамещенный 0,5 г сернокислый магний 0,5 г лимонная кислота 2,0 г лимоннокислое аммиачное железо 0,05 г пируват натрия 0,5 г глицерин 40,0 г агар 15,0 г гумивит 90,0-95,0 мл сваренный вкрутую желток куриного яйца 50,0 г дистиллированная вода до 1000,0 мл