ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУЛЯРЕМИИ Российский патент 2008 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к клинической и ветеринарной микробиологии, наиболее эффективно может быть использовано для выращивания возбудителя туляремии и может найти практическое применение в санитарно-эпидемиологических и научно-исследовательских учреждениях Минздрава, Минобороны, МЧС России, занимающихся вопросами лабораторной диагностики возбудителя туляремии.

Известна питательная среда (Е.А.Смирнова, Л.В.Комиссарова. Питательная среда для выращивания туляремийных бактерий. В кн. Актуальные вопросы разработки препаратов медицинской биотехнологии. Тезисы конференции 26-27 мая 1988 г. Ч.I. Махачкала, 1988), в состав которой входят: сухой питательный агар рыбный, глюкоза, натрий углекислый и совокупность аминокислоты, витамина группы В и кетокислоты.

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при использовании известной питательной среды, относится то, что среда имеет низкие ростовые свойства в отношении возбудителя туляремии ввиду отсутствия стимуляторов роста гемофильных микроорганизмов, к которым относится кровь или вещества, полученные из нее.

Известна питательная среда для выращивания туляремийного микроба (А.З.Равилов, Л.Я.Гильмутдинов, М.Ш.Хусаинов. Микробиологические среды. Казань, 1999), состоящая из панкреатического гидролизата рыбной муки, агара Д, цистеина гидрохлорида, глюкозы, калия фосфорнокислого, активированного угля и раствора черного альбумина.

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при использовании известной питательной среды, относится то, что эта среда обладает низкой чувствительностью в отношении возбудителя туляремии, т.е. при высеве 100 М.К. на чашки Петри наблюдается рост лишь одиночных колоний.

Наиболее близкой к заявляемому изобретению питательной средой по совокупности признаков является питательная среда (FT-агар) (Каталог микробиологических питательных сред, их компонентов и другой продукции. Отделение «Питательные среды» ГНЦПМ, п.Оболенск, 2001), в состав которой входят следующие компоненты:

сернокислотный гидролизат рыбной кормовой муки марки ФГС - 17,0 г·дм^-3;

стимулятор роста гемофильных микроорганизмов - 5,0 г·дм^-3;

экстракт пекарских дрожжей - 2,3 г·дм^-3;

магний сернокислый 7-водный - 0,5 г·дм^-3;

натрий сернистокислый - 0,7 г·дм^-3;

цистин - 0,5 г·дм^-3;

агар - 0,8...12,0 г·дм^-3.

При культивировании микроорганизмов в данную среду вносится глюкозо-витаминная добавка.

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при использовании известной питательной среды, принятой за прототип, относится то, что состав данной среды не обеспечивает возможность накопления биомассы Fr. tularensis в достаточных количествах за непродолжительное время культивирования посевов.

Технический результат - повышение скорости роста и эффективности питательной среды в отношении Fr. tularensis.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что питательная среда для выращивания возбудителя туляремии, содержащая питательную основу, минеральные вещества, агар-агар, витамины, экстракт пекарских дрожжей, цистин, дополнительно содержит железо сернокислое, в качестве витаминов - тиамин хлорид и никотиновая кислота, а в качестве питательной основы и стимулятора роста гемофильных организмов - ферментативный гидролизат крови КРС при следующем количественном содержании компонентов (г·дм^-3):

магний сернокислый0,500натрий сернистокислый0,700железо сернокислое0,030цистин0,500глюкоза10,000тиамина хлорид0,005кислота никотиновая0,008экстракт пекарских дрожжей3,500агар20,000ферментативный гидролизат крови КРС, разведенный дистиллированнойводой до содержанияаминного азота (170±10) мг% остальное

Только при вышеперечисленных составе и концентрациях компонентов питательной среды достигается указанный технический результат.

Наличие причинно-следственной связи между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом показано в таблице 1.

Изобретение позволяет повысить скорость роста и эффективность питательной среды в отношении Fr. tularensis за счет дополнительного введения в ее состав железа сернокислого, тиамина хлорида, никотиновой кислоты, а в качестве питательной основы и стимулятора роста гемофильных организмов - ферментативного гидролизата крови КРС.

Использование в составе заявляемой среды дополнительных компонентов не оказывает отрицательного влияния на ее качества по физико-химическим и биологическим характеристикам.

Состав и возможность применения заявляемой питательной среды для выращивания возбудителя туляремии подтверждены нами экспериментальным путем и не известны из доступных источников информации.

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами:

Пример 1. Приготовление ферментативного гидролизата крови

Техническую цельную кровь крупного рогатого скота (КРС) подвергают гидролизу ферментом при температуре (38±1)°С в течение 72 часов при рН (7,5±0,3) ед. рН с последующим прогреванием и фильтрацией.

Пример 2. Приготовление питательной среды

К расчетному количеству ферментативного гидролизата крови, разведенному дистиллированной водой до содержания аминного азота (170±10) мг%, добавляют навески солей (магний сернокислый 7-водный, натрий сернистокислый), экстракт пекарских дрожжей, цистин, предварительно растворенный в растворе соляной кислоты, агар. Смесь перемешивают, нагревают до кипения и кипятят до полного растворения компонентов и расплавления агара, отбирают пробу для корректировки значения показателя рН в пределах (7,3±0,1) ед. рН. Полученную смесь фильтруют через двойной марлевый фильтр в подходящую тару. По окончании процесса фильтрации в полуфабрикат питательной среды вводят 0,3%-ный раствор железа сернокислого из расчета 10 см³ раствора на 1 дм³ полуфабриката, перемешивают, фасуют в соответствующую стеклянную тару и стерилизуют в течение 20 минут при температуре (123±2)°С. Входящие в состав питательной среды глюкозу и витамины используют в виде отдельно приготовленного раствора (ГВД-глюкозо-витаминная добавка). Для этого 500 г глюкозы растворяют в 500 см³ дистиллированной воды, в раствор вводят 0,25 г тиамина хлорида (витамин В 1) и 0,4 г никотиновой кислоты. Раствор перемешивают до растворения витаминов, фильтруют через марлевый фильтр, фасуют во флаконы, стерилизуют в течение 20 минут при температуре (123±2)°С.

Раствор ГВД вводят в полуфабрикаты питательных сред при культивировании из расчета 10 см³ раствора ГВД на 1 дм³ полуфабриката.

Охлажденную до температуры 45...50°С среду разливают асептически по 15...20 см³ в стерильные чашки Петри с открытыми крышками, которые после застывания среды закрывают.

В качестве контрольной используют среду (FT-агар) (Отделение «Питательные среды» ГНЦПМ, п.Оболенск), которую готовят в соответствии с прилагаемой инструкцией.

Пример 3. Использование питательной среды для выращивания Fr. tularensis.

Для определения ростовых свойств питательной среды используют штаммы Fr. tularensis №15 НИИЭГ и Fr. tularensis №503/840. Тест-культуры получают в лиофилизированном виде из ГИСК им. Л.А.Тарасовича. Для проверки качества питательных сред используют 48-часовые культуры туляремийного микроба, выращенные на желточной среде Мак-Коя при температуре 37°С. Из этих культур готовят взвеси микробов в 0,9%-ном растворе хлористого натрия. Доводят концентрацию микробной взвеси до 10 единиц по стандартному образцу мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича ОСО 42-25-59-86П и разводят в 5 раз (к 1 см³ взвеси добавляют 4,0 см³ 0,9%-ного раствора хлористого натрия). Полученное разведение культуры эквивалентно 1.10⁹ м.к·см^-3. Из исходных стандартных взвесей готовят десятикратные разведения путем последовательного переноса 0,5 см³ культуры в 4,5 см³ 0,9%-ного раствора хлорида натрия.

По 0,1 см³ микробной взвеси из разведения 10^-6 и 10^-7 (1·10³ и 1·10² м.к·см^-3) Fr. tularensis №15 и Fr. tularensis №503/840 наносят на поверхность среды (по три чашки Петри на каждое разведение) и распределяют по поверхности среды покачиванием. Культуру выращивают в термостате при температуре (37±1)°С в течение (35±3) ч.

Показатель скорости роста определяют по минимальному времени инкубации культур, в течение которого на среде формируются типичные по морфологии колонии туляремийного микроба. Чувствительность сред оценивают по минимальной посевной дозе, при которой наблюдается рост туляремийного микроба на средах. Эффективность оценивают по количеству м.к. туляремийного микроба, выращенного на питательных средах. Показатель стабильности морфологических свойств туляремийного микроба определяют по отношению числа колоний, атипичных по морфологии к общему числу колоний на чашках. Результаты представлены в таблицах 2 и 3.

Из представленных в таблице 2 данных видно, что заявляемая среда обеспечивает рост в достаточном количестве типичных колоний Fr. tularensis.

Результаты, обобщенные в таблице 3, убедительно свидетельствуют о том, что на заявляемой питательной среде по сравнению с прототипом за более короткое время инкубации посевов вырастает большее количество биомассы тест-штаммов возбудителя туляремии.

Таблица 1Причинно - следственная связь между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемым техническим результатомВиды технического результата и их размерностьПоказатели фактические или расчетныеПодробное объяснение за счет чего (отличительный признак и (или) их совокупность) стало возможным улучшение предлагаемого объекта по сравнению с прототипомПрототипа*Заявляемого объектаСкорость роста (образование макроколоний) Fr. tularensis. на поверхности среды, ч36...3927...30Обусловлено тем, что питательная среда для выращивания возбудителя туляремии дополнительно содержит железо сернокислое, в качестве витаминов - тиамин хлорид и никотиновая кислота, а в качестве питательной основы и стимулятора роста гемофильных организмов - ферментативный гидролизат крови КРС, при следующем количественном содержании компонентов, (г·дм^-3):Выход микробной биомассы Fr. tularensis с 1 мл среды (эффективность), млрд·см^-3195...200260...285магний сернокислый - 0,500;натрий сернистокислый - 0,700;железо сернокислое - 0,030;цистин - 0,500;глюкоза - 10,000;тиамина хлорид - 0,005;кислота никотиновая - 0,008;экстракт пекарских дрожжей - 3,500;агар - 20,000;ферментативный гидролизат крови КРС, разведенный дистиллированной водой до содержания аминного азота (170±10) мг% - остальное.* Примечание. В качестве прототипа выбрана среда (FT-агар) (Отделение «Питательные среды» ГНЦПМ, п.Оболенск)

Таблица 2Оценка ростовых свойств питательных средНаименованиеХарактер роста, число выросших колонийПредложенная питательная средаНа чашках Петри с питательной средой через (27-30) ч инкубации при (37±1)°С наблюдался рост тест-штаммов в количестве 60...70% от посевных доз 1-10 м.к·см^-3 в виде серых блестящих колонной не менее 1-1,5 мм в диаметре типичной формыFT-агар (прототип)На чашках Петри с питательной средой через (36-39) ч инкубации при (37±1)°С наблюдался рост тест-штаммов в количестве 45...50% от посевных доз 1·10³ м.к·см^-3 в виде серых блестящих колонной не менее 1-1,5 мм в диаметре типичной формы

Таблица 3Оценка питательных сред по биологическим показателямНаименованиеОпределяемые показателиЧувствительность, разведениеЭффективность, млрд·см^-3Стабильность по морфологическим свойствам, %Скорость роста (образование макроколоний) на поверхности среды, чПредложенная питательная среда10^-6260...28598...9927...30FT-агар (прототип)10^-6195...20095...9736...39

Среда содержит, г/л: магний сернокислый - 0,5; натрий сернокислый - 0,7; железо сернокислое - 0,03; цистин - 0,5; тиамина хлорид - 0,005; глюкоза - 10,0; кислота никотиновая - 0,008; экстракт (автолизат) пекарских дрожжей - 3,5; агар-агар - 20; ферментативный гидролизат крови крупного рогатого скота, разведенный дистиллированной водой до содержания аминного азота 160-180 мг % - остальное, используемый в качестве питательной основы и стимулятора роста гемофильных организмов. Изобретение обеспечивает расширение арсенала питательных сред для культивирования туляремийного микроба, повышает эффективность выращивания, сокращает продолжительность культивирования. 3 табл.

Питательная среда для выращивания возбудителя туляремии, содержащая питательную основу, магний сернокислый, натрий сернокислый, агар-агар, витамины, экстракт пекарских дрожжей, цистин, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит железо сернокислое, в качестве питательной основы и стимулятора роста гемофильных микроорганизмов - ферментативный гидролизат крови крупного рогатого скота, разведенный дистиллированной водой до содержания аминного азота 160-180 мг %, а в качестве витаминов - тиамин хлорид и никотиновую кислоту при следующем количественном содержании компонентов, г/л:

магний сернокислый0,500натрий сернокислый0,700железо сернокислое0,030цистин0,500глюкоза10,000тиамина хлорид0,005кислота никотиновая0,008экстракт пекарских дрожжей3,500агар-агар20,000ферментативный гидролизат крови крупного рогатого скота, разведенный дистиллированной водой до содержания аминного азота 160-180 мг %,остальное