Питательная среда для выращивания туляремийного микроба Советский патент 1989 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к микробиологии и касается питательной среды для вьфащивания туляремийного микроба. Известна питательная среда для вьфащивания тyляpe шйнoгo микроба, содержащая гидролизат свежей рыбы, гидролизат желатина, аутолизат дрожжей, натрий зшорид, глюкозу, цистин, агар-агар, дефибринированную кровь кролика в воду. Известна также питательная среда для вьфащивания туляремийного микроба, содержащая белковую основу панкреатический гидролизат кильки,Lцистеин, глюкозу, стимуляторы роста экд, раствор черного альбумина, минеральные соли - NaCl, , К2НР04, активированный уголь, агар и воду. Однако известные питательные среды не обеспечивают высокой чувствительности среды и ускорения роста туляремийного микроба и для повьшеНИН ростовых качеств среды необходим предварительная активация культуры. Целью изобретения является повышение чувствительности среды и ускорения роста туляремийного микроба. Эта цель достигается Тем, что питательная среда для вьфащивания туля ремийного микроба, содержащая белковую основу, L-цистеин, глюкозу, стимуляторы роста, минеральные соли, агар и воду, в качестве белковой основый содержит фосфорнокислотный гид ролизат водонерастворимого остатка плазмолизированных парафинокислякицих дрожжей, в качестве стимуляторов РОС та содержит экстракт плазмолйзированных парафинокисляющих дрожжей, цитрат натрия «5,5 , лиридоксин, гидрохлорид и ЭДТА - динатриевую соль, в качестве минеральных солей сульфит натрия, калий фосфорнокислый двузамещенный, калий углекислый, железо сернокислое закисное семиводное /и магний сернокислый при следзтощем количественном соотношении компонентов, г/Л Фосфорнокислотный, гвдролизат водонерастворимо го остатка плазмолизированных парафинокисля- ющих дрожжей15-30 L-цистеин0,4-г1,2 Глюкоза10-30 Экстракт плазмолизированных парафинокисляющих дрожжей0,5-2 Цитрат натрия-5,5 0,5-2 Циридоксин гидрохлорид 0,005-0,02 ЭДТА-динатриевая соль 0,02-0,1 Сульфат натрия Калий фосфорнокислый двузамещенный2-6Калий углекислый 0,5-1,5 Железо .сернокислое закисное семиводное 0,05-0,2 Магний сернокислый 0,025-0,1 Агар 10-11 Вода До 1 л Приготовление и использование питательной среды иллюстрируется следую щими примерами. И р и м е р 1. Парафинокисляющие плазмолизированные дрожжи заливают 100-л водопроводной воды, перемешивают 10 мин и отстаивают 90 мин. Надосгщочную жид- , кость (зкстракт) декантируют и упаривают в пищеварочном котле в 4 раза (до 5-6% концентрации сухих веществ), и добавляют, перемешивая, 70 г , рН доводят до 6,8, нагревают до кипения и фильтруют через фильтр. . Сальникова с бельтингом и фильтровальной бумагой, а .затем высушивают на распьшительной сушке при на входе и на выходе. Неплотный осадок дрожжей, оставшийся после декантации экстракта, центрифугируют на проточной с пара- v торной центрифуге, осадок (водоне растворимую часть плазмолизированных дрожжей) суспендирзпот в 120 л воды, заливают по 60 л в автоклавы ВК-75. Помешивая, добавляют ортофосфорную кислоту до концентрации 2% и ведут гидролиз в течение 90 мин при 1,5атм. После охлаждения до рН гидролизата доводят до 4,3-4,5 добавляя Са(ОН)., Гидролизат оставляют на ночь, надосадочную жидкость декантирзпот, а осадок центрифугируют. Цент;рифугат смешивают с декантантом и к смеси добавляют CaCOH -i до рН 9,2. Образовавшийся преципитат отделяют фильтрацией через фильтр Сальникова с бельтингом и фильтровальной бумагой. К фильтрату добавляют соляную -кислоту до рН 6 и сушат распылительной сзпшсой ( на входе, .на выходе) .

15 г дрожжевого гидролизата растворяют в 0,5 л дистиллированной воды, добавляют 5,6 г угля Б-кислый, перемешивают в течение 1 ч, уголь отделяют фильтрованием через 2 слоя фильтровальной бумаги, К раствору гидролизата добавляют одномоментно при перемешивании 5 г дрожжевого экстракта, 10 г глюкозы. О,А г L-цистеина солянокислого, 0,5 г цитрата натрия -5,5 , 0,02 г ЭДТА-динатриевой соли, 2 г KiHP04, 0,05 г FeS04 х X 7 %0, 0,025 г MgS04, 0,005 г пиридоксина гидрохлорида, 0,05 г KjCp, перемешивают до растворения, Добавляют воду до 1 л КОН до рН 7 и агарпорошок 10 г. Через 20 мин средуварят до расплавления агара, охлаждают до 45 С, добавляют, перемешивая, 0,4 г сульфита натрия в 10 мл воды.

Если нежелательно стерилизовать среду, добавляют антибиотики (натриевую соль ампициллина и полимиксина М сульфата 50 и 100 мг соответственно) в 5 мл воды.

Агар разливают в чашки и подсуишвают до удаления конденсата,

При посеве культуры Fr, tularensis № 15 в количестве 100 м,кл, выросло 37 + 2 колоний. Видимые колонии появились через 40 ч, размер 1,5-2 мм через 3 сут,

П р и м е р 2,

Навеску 26,05 г дрожжевого гидролизата растворяют в 0,5 л воды и сорбируют 9,84 г угля, К абсорбированному гидролизату одномоментно добавляют 8,75 г дрожжевого экстракта, 15 г глюкозы, 0,8 г L-цистеина солянокислого, 1 г цитрата натрия, 0,05 г ЭДТА-динатриевой соли, 4 г , 0,1 г FeS04-7H O, 0,05 MgSO., 1 г K/jCOj, 0,01 г пиридоксина гидрохлорида, смесь перемешивают до растворения, добавляют воду 1 л, КОН до рН 7 и 10г агара. Среду варят, охлаждают до , добавляют 0,6 г сульфита натрия, и при необходимости антибиотики, как в примере 1,

Процент прорастания вакцинного штамма № 15 при посеве 100 клеток составил 86 ± 4, Видимые колонии появлялись на 36 ч и достигали 2,5-3 ым через 3 сут,

П р и м е р 3,

30 г дрожжевого гидролизата растворяют в 0,5 л воды, добавляют 12,4 г угля, К раствору сорбированного гидролизата добавляют дрожжевой экстракт 10 г, глюкозу 30 г. L-цистеин солянокислый 1,2 г, цитрат натрия х X 5,5 Н-гО 2 г, MgS04 0,1 г, пиридоксин тидрохлорид 0,02 г, K,jCOj 1,5 г, перемешивают до растворения, доводят рН до 7 и агар порошок 11 г. Среду варят и после охлаждения до добавляют сульфит натрия 1 г и антибиотики , как в примере 1,

Процент прорастания штамма № 15 при посеве 100 клеток составил 75 ± +3, Ввдимые колонии появлялись на 40 ч и достигают 2-2,5 мм через 3 сут,

Пример4,

Навеску (70 г) сухой питательной среды, приготовленной как в примере 2, суспендируют в 1 л дистиллированной воды, оставляют стоять в течение 20 мин, затем добавляют 5 М КОН до рН 7,6, Среду варят до исчезновения крупной пены и стерилизуют автоклавированием при в течение 20 мин,

В остывшую до среду добавляют 6 мл стерильного 10% раствора с сульфита натрия (до конечной концентрации 0,06%), тщательно перемешивают и разпивают в чашки. Чашки со средой подсушивают в стерильных условиях и засевают, .

При посеве 100 микробных клеток процент прорастания составил 31 t 5 для вакцинного штамма № 15, 82 + 8 для вирулентного штамма № 9 и 36 + 3 для вирулентного штамма Е-261,

П р и м е р 5,

Ш тательная.среда бьша испытана для вьфащив;ания возбудителя из объектов окружающей среды - трупов поле- вок, воды открытых водоемов и др.

Данные проведенных исследований приведены в табл, 1-2,

Использование питательной среды позволяет повысить скорость роста возбудителя, чувствительность среды, а также упростить технологию изготовления среды, так как среду можно использовать без автоклавирования и упростить диагностику, благодаря прозрачности среды.

51085230

Выделение туляремийных культур из полевого материала прямым посевом на среду АДТ (по изобретению)

Таблица1.

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА, содержащая белковую основу, L-цистеин, глюкозу, стимуляторы роста, минеральные соли, агар и воду, отличаю а я с я тем, что, с целью повышения чувствительности среды и ускорения роста туляремийного микроба, она в качестве белковой основы содержит фосфорнокислотный гидроли- зат водонерастворимого остатка плазмолизированных парафинокиспяющих дрожжей, в качестве стимуляторов роста содержит экстракт плазмолизирован-,ных парафинокисляющих дрожжей, цит;рат. натрия- 5,5 , пиридоксин гидрохлорид и ЭДТА-динатриеву$о соль, в качестве минеральных солей - сульфит натрия, калий фосфорнокислый двузамещенныйI калий углекислый, железо сернокислое закисноё семиводное и магний сернокисльй при следз щем количественном соотношении компонентов, г/л: Фосфорнокислотный гидролизат водонерастворимого хзстатка плазмолизированных парафинокисляющнх дрожжей115-30 L-цистеин0,4-1,2 Глюкоза10-30 (Л Экстракт плазмолизированных парффинокислякяцих дрожжей- 5-10 Цитрат натрия-5, 0,5-2 Пиридоксин гидрохлорид 0,005-0,02 ЭДТА - динатриевая соль 0,02-0,1 Сульфит натрия0,4-1 фосфорнокислый двузамещенный2-т6 Калий углекислый 0,5-1,5 Железо сернокислое за- кисное семиводное 0,5-0,2 Магний сернокислый 0,025-0,1 Агар10-11 ВодаДо 1 л

Среднеарифметический срок Сравнительные данные по чувстви:тельности и питательных средах

начальный рост 0, мм через через 24 ч 48 ч 67 100 на 4-е Известная . кёшонии - - ММ,

1,12-1,8 мм через А8 ч сутки единич. ,2 Та б л и ц а 2 росту возбудителя на на 5-е на 4-е на 5-ена. 5-е сутки сутки сутки ; сутки ед.кол. един. един.един. 0,2-0,5 кол. кол.кол. мм 0,1-0,3 . - , , . - ..