Питательная среда для культивирования FRaNcISeLLa тULаRеN SIS Советский патент 1992 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для накопления биомассы и при диагностике туляремии.

Цель изобретения - повышение ростовых свойств среды и выхода биомассы.

Поставленная цель достигается тем, что среда, содержащая питательную основу, стимуляторы роста, цистеин, глюкозу, агар и дистиллированную воду, дополнительно содержит сернокислый магний и сернисто- кислый натрий, в качестве питательной основы она содержит забуференный гидролизат рыбной кормовой муки. рН 6.9-7.2; а в качестве стимуляторов роста - ферментолизат черного альбумина и дрожжевой экстракт или смесь витаминов группы В при следующем соотношении компонентов г/л:

Забуференный гидролизат рыбной кормовой муки, рН 6,9-7,216,0-18,0

Ферментолизат черного альбумина4,0-6,0

Дрожжевой экстракт или 1,5-2,5 смесь витаминов группы В0,014-0,018 Сернокислый магний 0,45-0,55 Сернистокислый натрий 0,65-0,75 Цистеин0,4-0,6 Глюкоза2,0-11,0 Агар10,0-12,0 Дистиллированная вода До 1 л причем смесь витаминов содержит тиамин и пантотенат кальция в равных количествах. П р и м е р 1. Приготовления среды производится следующим образом.

ч|

со

О

Ј CJ

1.Получение гидролизата PC. Сернокислотный гидролиз рыбной

кормовой муки проводят при температуре 131 ±2°С в течение 2 ч. Далее последовательно проводят следующие операции: первичная фильтрация, деионизация, осветление, вторичная фильтрация.В обработанный по этой схеме гидролизат для со- здания необходимой буферности и осмомолярности вводят минеральные соли: одно- и двузамещенные фосфаты калия, хлористый натрий. Гидролизат прогревают, фильтруют, устанавливают значение рН 7,2 ± 2,0 и сушат в распылительной сушилке.

2.Получение стимулятора роста (СРГМ).

Ферментолиз черного альбумина проводят протосубтилином Г 10-X, Г 3 X при температуре 50 ± 2°С в течение 40 мин. Затем реакционную смесь прогревают при 120°С ± 2°С в течение 30 мин, охлаждают до 60-70°С, фильтруют и сушат на распылительной сушилке.

3.Для определения оптимальных концентраций ингредиентов готовят питательную среду следующего компонентного состава, г/л:

Гидролизат PC16,0

СРГМ2.0

Цистеин0,4

Дрожжевой экстракт1.5

Смесь витаминов0,014

Глюкоза2.0

МдЗСм 7Н200.45

№230з0.65

Агар10,0

Дистиллированная водаДо 1 л

растворяют в дистиллированной воде и кипятят 10-15мин, не допуская пригорания.

Среды охлаждают до 45-50°С и вводят факторы селективности, мг/л:

Кефзол10

или цефалексин20

Амфотеррицин10

Амфоглюкамин40

Ристомицин40

Факторы селективности вводят во все среды, стерилизуемые кипячением, а также в случае приготовления селективных вариантов. При стерилизации автоклавировани- ем среда нагревается до расплавления агара и стерилизуется при 110°С в течение 30 мин.

П р и м е р 2. Среду готовят аналогично примеру 1 при следующем соотношении ин-. гредиентов, г/л:

Гидролизат PC18,0

СРГМ6,0

Цистеин0,6

ДЭ или2,5

смесь витаминов0,018

Глюкоза11,0

MgS04 7Н2б0,55

N323030,75

Агар12,0

Дистиллированная водаДо 1 л

П р и м е р 3. Среду готовят аналогично примеру 1 при следующем соотношении компонентов, г/л:

Гидролизат PC17,0

СРГМ5,0

Цистеин0,5

ДЭ или2,0

смесь витаминов0,016

Глюкоза5,0

МдЗСм 7Н200,5

Na2SC 30,7

Агар11,0

Дистиллированная водаДо 1 л

Для удобства применения, транспортирования, а также с целью стандартизации среды разработан вариант сухой питательной среды предлагаемого состава. Приме, р 4. Для получения 1 кг сухой

питательной среды необходимо смешать в смесителе барабанного типа ингредиенты среды в количестве, г:

Гидролизат PC383,0

СРГМ106,5

ДЭ или42,6

смесь витаминов0,340

Цистеин10,7

Глюкоза213,0

МдЗСм 7Н2010,7

N3230314,9

Агар234,3

Сухую среду расфэсовывают в соответствующую тару, герметично упаковывают и хранят в сухом месте при температуре не выше35°С.

Для приготовления 1 л питательной среды, необходимо 47 г порошка тщательно размешать в 1000 мл дистиллированной воды, простерилизовать по примеру 1 и разлить в чашки Петри, пробирки, матрацы.

П р и м е р 5. Экспериментальная проверка ростовых свойств среды.

В качестве тест-штаммов используют вакцинный штамм № 15 НИИЭГ и вирулентный №503 F.tularensis. В качестве среды сравнения (контроля) используют известную среду. Проверку ростовых свойств среды проводят, определяя следующие показатели: чувствительность среды (минимальна посевная доза, вызывающая рост тест-штаммов); показатель прорастания (процентное отношение числа колоний, сформировавшихся на испытуемой среде, к

числу таковых на контроле); скорость роста (время появления типичных колоний): продуктивность среды (выход биомассы с 1 мл среды).

Для определения эти показателей используют икокуляты из 2-суточных культур тест-штаммов, выращенных ка среде Мак- Кая. Посевной материал, содержащий 5 10 ,50,500м.к./мл, готовят по стандарту мутности ГИСК на 10 ед. путем десятикратных разведений в физиологическом растворе.

Для определения чувствительности, показатели прорастания, скорости роста взвеси тест-штаммов с концентрацией 50 и 500 м.к./мл высевают на 5 агаровых пла- . стин с вариантами сред N 1.2.3.4 и контролем по 0,1 мл на каждую.

В таблице приведены ростовые свойства питательных сред, полученных согласно примерам.

Из представленных данных видно, что предлагаемая среда для диагностики туляремии отвечает требованиям, предъявляемым к этим средам. Культуры F tularensis, получаемые на этой среде, типичны по куль- туралько-морфологическим свойствам.

Для определения продуктивности среды засевают 5 пробирок со скошенным агаром 0,2 мл взвеси с концентраций 5 106 кл/мл и инкубируют посевы при 37°С втечение 48 ч. О продуктивности судят по количеству жизнеспособных клеток в полученной биомассе. Из полученных данных следует, что продуктивность предлагаемой среды находится на уровне 35 -10 кл/мл, что в 1.5 раза превышает продуктивность известной среды.

Использование среды позволяет при упрощении технологии приготовления повысить эффективность бактериологических

исследований при диагностике турялемии, увеличить выход биомассы при производств туляремийных диагностикумов, а также отказаться от использования крови в пита- тельных средах.

CD op мула изобретения Питательная среда для культивирования Francisella tularensis, содержащая питательную основу, стимуляторы роста, цистеин. глюкозу, агар и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения ростовых свойств среды и выхо да биомассы, она дополнительно содержит сернокислый магний и сернистокислый натрий, в качестве питательной основы она содержит забуференный гидролиззт рыбной кормовой муки, рН 6,9-7.2, а в качества

5

0

0

стимуляторов роста - ферментолизат черного альбумина и дрожжевой экстракт или смесь витаминов группы В при следующем соотношении компонентов, г/л: Забуференный гидроли- зат рыбной кормовой . муки, рН 6.9-7,216,0-18,0

Ферментолизат черного альбумина 4.0-6,0 Дрожжевой экстракт или1,5-2,5 смесь витаминов труп- . пы В 0,014-0,018 Сернокислый магний 0,45-0,55 Сернистокислый натрий 0,65-0,75 Цистеин . 0,4-0,6 Глюкоза 2,0-11,0 Агар10,0-12,0 Дистиллированная, вода До 1 л 2. Питательная среда по п. 1. о т л и ч a torn, а я с я тем, что смесь витаминов содержит тиамин и пантотенатвкальция в равных количествах.

Использование: микробиология, диагностика туляремии, получение биомассы бактерий. Francisella tularensis. Сущность изобретения заключается в том, что питательная среда состоит из следующих компонентов: забуференный гидролизат рыбной кормовой муки, ферментолизат черного альбумина, дрожжевой экстракт или смесь витаминов группы В, сернокислый магний, сернокислый натрий, цистеин, глюкоза, агар и дистиллированная вода. Культуры F.tularensis, выращенные на этой среде, типичные по культурально-мбрфологическим свойствам. Среда позволяет упростить и повысить эффективность бактериологических исследований при диагностике туляремии, увеличить выход биомассы при производстве тулляремийных диагностикумов, 1 табл. сл С