ШТАММ ЛЕГИОНЕЛЛЕЗНОГО БАКТЕРИОФАГА НИИМ, АКТИВНЫЙ В ОТНОШЕНИИ LEGIONELLA PNEUMOPHILA, L. MICDADEI, L. DUMOFFII И L. BOZEMANII Российский патент 2004 года по МПК C12N7/00 C12N7/04 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к средствам лабораторной диагностики легионеллеза, и может быть использовано в научных и практических лабораториях, занимающихся идентификацией возбудителей болезни легионеров, выделяемых из организма больного и инфицированных объектов внешней среды.

Известны многие бактериофаги, используемые для идентификации и фаготипирования бактерий различного систематического положения (Медицинская микробиология/ Гл. ред. В.И.Покровский, O.K.Поздеев - М.: ГЭОТАР Медицина, 1999). Общими по отношению к заявляемым фагам являются этапы их получения, состоящие в выделении и накоплении фаговых частиц, проверки специфичности свойств и использования в целях лабораторной диагностики. Однако известные бактериофаги не могут быть использованы для идентификации и фаготипирования легионелл в связи с высокой специфичностью механизмов взаимодействия бактерий и паразитирующих в них вирусов. По этой причине они не способны адсорбироваться на поверхности клеток легионелл, репродуцироваться в них и вызывать их лизис.

Штаммы специфических легионеллезных бактериофагов в научной и патентной литературе не описаны.

Задачей изобретения является получение специфического штамма легионеллезного бактериофага, предназначенного для идентификации основных видов возбудителей болезни легионеров и лабораторной диагностики легионеллеза.

Решение задачи достигается путем выделения бактериофага из органов лабораторных животных, инфицированных типовым штаммом Филадельфия-1 Legionella pneumophila.

С целью выделения однородной популяции фага проведена селекция негативных колоний. Чистая линия фага НИИМ была получена путем пятикратного пассирования отдельных негативных колоний на штамме Филадельфия-1 L. pneumophila.

Штамм бактериофага НИИМ хранится в коллекции фагов Научно-исследовательского института микробиологии МО РФ (г. Киров) и характеризуется следующими морфологическими и физиологическими свойствами.

Фаг НИИМ относится к третьей морфологической группе вирусов бактерий по А.С.Тихоненко (1968 г.). Корпускулы фага состоят из многогранной удлиненной головки, в проекции растянутой гексагональной формы, размером 600×300 и короткого отростка длиной 150±50 (фиг.1-3). Тип нуклеиновой кислоты - ДНК, молекулярный вес - 13·10⁶ Да.

Негативные колонии формируются на двухслойном BCYEa-агаре, приготовленном по методу Грациа, с типовой индикаторной культурой L. pneumophila штамма Филадельфия-1. Через 72-96 часов инкубации при температуре 35-37°С образуются прозрачные колонии округлой формы с относительно ровным краем 1,5-2,5 мм в диаметре. Нанесение фаговой суспензии на газон индикаторной культуры по методу Отто вызывает через 48-72 часа термостатирования при температуре 35-37°С образование четкой зоны специфического лизиса.

Адсорбция фага индикаторными бактериями в жидкой среде, содержащей 15 г/л протеозопептона №3, 10 г/л дрожжевого экстракта, 4 г/л К₂НРO₄, 1 г/л КН₂РO₄, 0,042 г/л NaНСО₃, 0,25 г/л пирофосвата железа, 0,4 г/л L-цистеина, остальное - дистиллированная вода (Прозоровский С.В., Покровский В.И., Тартаковский И.С. Болезнь легионеров. - М.: Медицина, 1984, с.208), составляет 90%, латентный период - 2 часа, урожайность - 175 корпускул на инфицированную клетку.

При посевной дозе n·10⁶ микробных клеток 3-суточной бульонной культуры в 1 см³ указанной среды и множественности инфекции 0,1 в течение 24 часов инкубирования при температуре 35-37°С накапливаются до n·10⁸ БОЕ·см^-3.

Фаг термолабилен. Инактивация начинается при температуре 50°С, а полное разрушение происходит после инкубации при температуре 55°С в течение 30 минут.

Антигенные свойства

При иммунизации кроликов суспензией фага с адъювантом Фрейда образуются специфические антитела. Полученная антисыворотка нейтрализует фаг с константой нейтрализации 43.

Специфичность

Бактериофаг высокоспецифичен и лизирует бактерии основных видов возбудителей легионеллеза: L.pneumophila (9 штаммов), L. micdadei, L. dumoffii и L. bozemanii. Фаг НИИМ не оказывает литического действия на Yersinia pestis (5 штаммов), Vibrio cholerae, Francisella tularensis, Bacillus anthracis, Brucella abortus, Y.pseudotuberculosis, Escherichia coli (4 штамма), Salmonella choleraesuis. Streptococcus faecium, equi, pneumoniae, Staphylococcus saprophyticus и aureus, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, Proteus vulgaris и mirabilis, Shigella sonnei и flexneri, Serratia marcescens, Pseudomonas aeroginosa.

На фиг.1 показаны частицы легионеллезного бактериофага НИИМ. Контрастирование уранилацетатом Х 120000.

На фиг.2 показана адсорбция частиц бактериофага НИИМ на поверхности L. pneumophila. Контрастирование уранилацетатом Х 30000.

На фиг.3 показан фаг НИИМ внутри клетки L.pneumophila. Контрастирование уранилацетатом Х 50000.

Пример. Фаг НИИМ репродуцируется на клетках штамма Филадельфия-1 L. pneumophila в среде, содержащей 15 г/л протеозопептона №3, 10 г/л дрожжевого экстракта, 4 г/л К₂НРO₄, 1 г/л КН₂РO₄, 0,042 г/л NаНСО₃, 0,25 г/л пирофоcвата железа, 0,4 г/л L-цистеина, остальное - дистиллированная вода.

При посевной дозе 2·10⁶ клеток возбудителя легионеллеза на 1 см³ среды и множественности инфекции 0,1 при инкубации в течение 24 часов при температуре 35-37°С накапливается до n·10⁸ фаговых частиц на 1 см³.

Для получения препарата фага НИИМ 48-часовую культуру штамма Филадельфия-1, выращенную на среде BCYEa-агар, вносят в жидкую питательную среду из расчета конечной концентрации 5·10⁶ клеток на 1 см³; после 48-72 часов подращивания при температуре 35-37°С и достижения культурой концентрации 2·10⁸ клеток на 1 см³ добавляют фаг НИИМ из расчета множественности инфекции 0,1-0,3. Через 24 часа инкубации к фаголизату добавляют хлороформ (1/35 часть хлороформа по объему). Фаголизат с добавленным хлороформом выдерживают 1,5-2 часа при комнатной температуре (18-22°С) и 12 часов в холодильнике (4-6°С). Затем фаголизат фильтруют через стерильные фильтры с размером пор 0,2 мкм. Полученный фильтрат разливают по ампулам и контролируют на специфическую, общую стерильность и активность.

Фаг НИИМ, подобно типовым фагам других видов, используют для фаготипирования основных видов возбудителей болезни легионеров в дифференцирующем рабочем титре (ДРТ).

ДРТ фага определяется следующим образом: 48-часовую культуру возбудителя легионеллеза штамма Филадельфия-1, выращенную на среде BCYEa-агара, в объеме 0,1 см³ с концентрацией 1,0 млрд бактериальных клеток по отраслевому стандарту мутности ГКИ, вносят в пробирки с 4,5 см³ расплавленного и остуженного до 47°С 0,7% BCYEa-агара (рН 6,95), добавляют в объеме 0,1 см³ десятикратные разведения фага НИИМ. Содержимое пробирки перемешивают и выливают на поверхность агаровой пластинки (1,5% BCYEa-агар, рН 6,95). После застывания второго слоя посевы инкубируют при 35-37°С в течение 3-6 суток. За ДРТ принимают то разведение, в котором фаг НИИМ образует не менее 10 негативных колоний.

Изучение чувствительности исследуемых культур к фагу НИИМ проводится так же, как и определение дифференцирующего рабочего титра.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для идентификации возбудителей болезни легионеров, выделяемых из организма больного и инфицированных объектов внешней среды. Штамм легионеллезного бактериофага, предназначенный для идентификации основных видов возбудителей болезни легионеров Legionella pneumophila, L. micdadei, L. dumoffii и L. bozemanii лабораторной диагностики легионеллеза, выделен из органов лабораторных животных, инфицированных типовым штаммом Филадельфия-1 L. Pneumophila, и депонирован в коллекции фагов НИИ микробиологии МО РФ под обозначением НИИМ. Использование бактериофага позволяет повысить специфичность идентификации возбудителя легионеллеза от других возбудителей инфекций. 3 ил.

Штамм легионеллезного бактериофага НИИМ, обладающий активностью в отношении Legionella pneumophila, L. micdadei, L. dumoffii и L. bozemanii.