Способ титрации овисных антигенов Советский патент 1979 года по МПК C12K1/00 

1

Изобретение относится к области микробиологии, в частности к способам титрации ОВИСНЫХ антигенов, и может быть использовано в ветеринарной лабораторной практике при контро ле специфичности и активности овисных антигенов.

Известен способ титрации овисных антигенов в реакции длительного связывания комплемента (РДСК), включающий разведение и инактивацию сывороток, разведение антигенов, титрацию комплемента, выдерживание бактериологической и гемолитической системы в холодильнике при 0-4 С в течение 16-18 ч, добавление оттитрованной дозы гемолитической системы,выдерживание в водяной бане при 37 С в течение 20 мин и учет реакции через 3-4,и 24 ч 1 и 2.

Недостатками описанного способа являются использование нестандартных сывороток, активность которых снижается в зависимости от срока хранения; невозможность концентрирования используемых сывороток до нужных значений; большое количество раведении сывороток; влияние неспецифических белков, содержащихся в сыворотках, на специфичность и чувствительность реакции, а следовательно, получение по этим сывороткам ОВИСНЫХ антигенов различной активности .

Целью изобретения является повышение специфичности, чувствительности и упрощение реакции.

Указанная цель достигается тем, что в качестве антител используют ли о фили 3 и р ов ан ный поли гл обули н.

Получение полиглобулина. 500 мл неконсервированной овисной сыворотки, полученной от одного или нескольких животных, нагревают до 40-42с, измеряют рН и при необходимости доводят до 7,5-7,6 0,1 н. раствором NaOH или нее, затем помещают в предварительно прогретый стакан гомогенизатора, добавляют 1,5% порошкообразного риванола (2-этокси-6,9-диаминоакридинлактата) и гомогенизируют в течение 3 мин при 2-2,5 тыс.об/мин Полученную вспененную массу фильтруют через капроновую ткань. Фильтрат помещают в холодильник при Т 4-7с на 2-3 суток для отделения свободного риванола. Затем раствор профильровывают через фильтровальную бумагу и в полученном прозрачном растворе определяют содержание белка коло-

риметрическим методом с биуретовым реактивом, а таклсе чистоту полученных фракций и нативность белка зональным электрофорезом на бумаге. При этом чистота белковых фракций должна составлять 95±5,0%, а содержание белка в растворе - 2-3%. Полученный раствор разливают в ампулы по 3 мл и высушивают лиофильно. Остаточная влажность должна быть не более 3%. После высушивания полиглобулина определяют количество сухого вещества в мг % в 5-6 ампулах (или флаконах) и выводят средний вес в одной ампуле (флаконе). После сушки раствор полиглобулина должен иметь рН 7,2-7,4, чистоту белковых фракций 95,0+5,0%.

Пример. Способ титрации овисных антигенов с применением полиглобулина.

Компоненты, используемые для титрации овисных антигенов в РДСК: раствор полнглобулина, содержащий в 1 мл 100 мг сухого вещества; испытуемые антигены; физиологический раствор с рН 6,8-7,0; негативные сыворотки баранов; S-бруцеллезная сыворотка; овисный антиген с известной активностью и специфичностью в рабочем разведении (1:100); антиген бруцеллезный для РСК в рабочем разведении (1:100); комплемент сухой для РСК активностью в бактериологической системе (в разведении 1:20), не ниже 0,31; сыворотка гемолитическая для реакции связывания комплемента с титром не ниже 1:2000; 4%-ная взвесь эритроцитов барана в физиологическом растворе.

Перед постановкой реакции рабочий раствор полиглобулина и S-бруцеллезную сыворотку разводят физиологическим раствором 1:5 и 1:10, а две негативные сыворотки - в соотношении 1:5. Испытуемые антигены разводят физиологическим раствором до 1:3001:500 (до предельного титра). Контрольные овисный и бруцеллезный антигены разводят физиологическим раствором 1:100. Комплемент разводят физиологическим раствором 1:20-1:30 в зависимости от титра.

Гемолитическую систему готовят из равных объемов 4%-ной взвеси эритроцитов барана в физиологическом растворе (из осадка эритроцитов, промытого 2-3 раза на центрифуге) и разведения в четвертом титре гемолитической сыворотки.

Последовательность способа титрации овисных антигенов в РДСК показана в табл. 1. Титрация гемолитической системы и определение ее рабочей дозы главного опыта представлены в табл. 2.

Полиглобулин, негативную и S-бруцеллезную сыворотки разливают в пробирки по 0,5 мл.

Для титрования гемолитической системы две негативные сыворотки, разливают в 10 пробирок по 0,5 мл.

Полиглобулин и сыворотки, разлитые в пробирки, инактивируют в водяной бане при 64-65 С в течение 30 мин, Испытуемый антиген разливают по 0,5 мл в пробирки с полиглобулином, негативной и S-бруцеллезной сыворотками .

Контрольный овисный антиген раэливают по 0,5 мл в пробирки для титрования гемолитической системы и в контрольный ряд пробирок с полиглобулином, негативной и S-бруцеллезной сыворотками. Комплемент разливают во все пробирки по 0,5 мл.

Все пробирки главного опыта и гемолитической системы выдерживают 16-18 ч при 0-4°С и 20 мин при комнатной температуре.

Затем титруют гемолитическую систему для определения ее рабочей дозы. Оттитрованную дозу гемолитической системы разливают во все пробирки главного опыта и выдерживают в течение 20 мин в водяной бане при 37-38°С.

Результаты реакции учитывают дважды: через 3-4 ч и через 24 ч. Реакцию оценивают в процентах гемолиза эритроцитов.

Антиген считается специфичным, если в разведении 1:25 и выше с негативными сыворотками в разведении 1:5 и с S-бруцеллезной сывороткой в разведении 1:5 и 1:10 не вызывает задержки гемолиза.

Антиген не должен обладать антикомплементарными свойствами, т.е. в контроле без сыворотки не должен вызывать задержки гемолиза эритроцитов.

Титром овисного антигена считается наибольшее его разведение, дающее полную задержку гемолиза эритроцитов с разведениями полиглобулина 1:5 и 1:10. Овисный антиген при титрации на полиглобулине должен выпускаться с двойным-тройным запасом активности (1:200 - 1:300) и применяться в разведении 1:100 (рабочий титр). При титрации антигена ставят следующий контроль:

1.Контроль антикомплементарных свойств полиглобулина и сывороток. К 1,0 мл полиглобулина или сыворотки в разведении 1:5 добавляют 0,5 мп

комплемента и рабочую дозу гемолитической системы. Результат - полный гемолиз.

2.Контроль антикомплементарНЕК свойств антигенов. К 1,0 мл антигена

в разведении 1:100 добавляют 0,5 мп комплемента и рабочую дозу гемолитической системы. Результат - полгный гемолиз.

3.Контроль гемотоксичнооти анти- генов. К 1,0 мл антигена добавляют 0,5 vm физиологического раствора и рабочую дозу гемолитической системы. Результат - полная задержка гемолиза. 4. Контроль резистентности эритро цитов. К 1,5 мл физиологического рас вора приливают рабочую дозу гемолитической системы. Результат - полная задержка гемолиза. Применение лиофилизированного полиглобулина вместо овисных сывороток, используемых в РДСК, имеет следующие преимущества: а)реакция антиген-антитело проходит более быстро и специфично, так как создаются условия для прямой свя зи соответствующих детерминантных групп антигена и антитела; кроме того, значительно снижается роль неспецифических реакций; б)вместо двух овисных сывороток разной активности используется один компонент - стандартный полиглобулин в)титрация антигена проводится в 1-2 разведениях полиглобулина вместо 12 разведений двух овисных сывороток г)в связи с отсутствием в полиглобулине балластных белков, не обладающих иммуногенной активностью, обеспечивается высокая специфичность реакции (РДСК); д)благодаря применению полиглобулина вместо сывороток значительно повышается чувствительность реакции; е)полиглобулин можно сконцентрировать до требуемых значений, поэтому его активность можно рассчитывать по содержанию в нем сухого вещества в 1 мл раствора и тем самым его стандартизировать; ж)срок хранения лиофильно высушенного полиглобулина практически не ограничен при стабильном сохранении всех свойств; з)в отличие от овисных сывороток полиглобулин дополнительно контролируется по иммунохимическим и физико-химическим показателям (чистота иммуноактивного белка, содержание его, нативность и т.д.), т.е. для реакции применяется компонент с заведомо известными свойствами; и) при постановке РДСК сокращается время и расход материалов на проведение титрации антигена. Титрация овисных антигенов различных серий с применением полиглобулина показала более высокую специфичность, чувствительность реакции и более простое осуществление способа, чем в случае применения двух овисных сывороток разной активности .

Схема титрации овисного антигена , Разведение полиглобулина/ сы0,5 0,5 0,5 0,5 Водяная баня при Испытуемый 0,5 0,5 0,5 0,5 антиген Комплемент в разведении по 0,5 0,5 0,5 0,5 титру Выдерживание 16-1 при комнатной тем Гемолитическая система в рабочем титре (см. схему титрации гемолитич. системы) 1,0 1,0 1,0 1/0 Водяная баня при

Таблица 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 64-65с в течение 30 мин 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 8 ч при 0-+ 4с и 20 мин пературе 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 37-38°С в течение 20 мин

Схема титрации гемолитической системы для реакции длительного связывания комплемента Негативная скйоротка В:раз0,5 ведении :: : Антиген в 0,5 рабочем титре Комплемент (в том же разведении, как для главн. 0,5 опыта) Гемолитичес0,2 кая система пг Результат Примечание:

Формула изобретения

Способ титрации овисных антигенов в реакции длительного связывания комплемента (РДСК), включающий разведение и инактивацию сывороток разведение антигенов, титрацию комплемента, выдерживание бактериологической и гемолитической системы в холодильнике при в течение 16-18 ч, добавление оттитрованной дозы гемолитической системы, выдерживание в водяной бане при 37°С в течение 20 мин и учет реакции через 3-4 и 24 ч, отличающийТаблица

с я тем, что, с целью повышения специфичности,чувствительности и упрощения реакции,в качестве антител используют лиофилизированный полиглобулин .

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

2.Триленко П.А. Диагностика инфекционного эпидидимита баранов с помощью РДСК, Ветеринария, 1970, № 8, с, 107-109. 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Водяная баня при в течение 30 мин 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Выдерживание 16-18 ч при О-1-4 °С и 20 мин при комнатной температуре 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 Водяная баня при 37-38°С в течение 20 мин пг пг пг пг пг чг чг чг зг Общий титр гемолитической системы - 1,2 мл ПГ - полный гемолиз, ЧГ - частичный гемолиз, ЗГ - задержка гемолиаа. Опыт проводится параллельно с двумя негативными сыворотками. рабочий титр - 1,0 мл