СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ АУТОАНТИТЕЛ, ЗАЩИЩАЮЩИХ ЭРИТРОЦИТЫ ОТ ГЕМОЛИЗА Российский патент 2007 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а более конкретно к гематологии и иммунологии, предназначено для диагностики аутоиммунных состояний больных, выявления наличия аутоантител к эритроцитам людей и животных и позволяет судить как о состоянии больного, так и о состоянии донорской крови.

Известны различные реакции для определения аутоантител: прямая реакция агглютинации лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов; непрямая реакция агглютинации частиц, нагруженных аутоантигеном преципитацией в геле или в буферном растворе; РСК; реакции потребления комлемента и иммуноглобулинов и др. (Красильников А.П., Романовская Т.Р. «Микробиологический словарь-справочник», Минск, 1999, стр.43).

Ни одна из перечисленных реакций не позволяет судить о наличии аутоантител, выполняющих, кроме своих физиологических функций, еще и функцию нейтрализации гемолитического яда стафилококов.

Наиболее близкой к заявляемому изобретению (прототипом) является реакция нейтрализации антигена (Никитин В.М. «Справочник серологических реакций», Кишинев, 1977, стр.162). Принцип указанной реакции основан на взаимодействии специфического антигена с исследуемой сывороткой и торможении (нейтрализации) гемагглютинации сенсибилизированных антителами эритроцитов, добавляемых в качестве индикатора на втором этапе.

Недостатком известной реакции нейтрализации антигена является сложность ее постановки и необходимость титрования антигена (то есть перед постановкой основной реакции нейтрализации антигена приходится ставить еще самостоятельную реакцию по определению титра антигена). Кроме того, необходимы постановка четырех контролей, а также специально сенсибилизированные антителами эритроциты.

Задачей изобретения является устранение указанных недостатков.

Поставленная задача решается в предлагаемом способе выявления аутоантител, защищающих эритроциты от гемолиза, позволяющем судить не только о наличии аутоантител к эритроцитам, но и о наличии антител, защищающих эритроциты от гемолиза микроорганизмами. Для определения уровня антиэритроцитарных аутоантител, препятствующих лизису гомологичных эритроцитов со стороны микробов (для чего, собственно, и предназначена предлагаемая реакция), из всех ингредиентов берутся только эритроциты больного и исследуемая сыворотка больного.

Сущность изобретения заключается в том, что готовят различные разведения сыворотки обследуемого больного в питательном агаре, вносят отмытые эритроциты больного до концентрации 3%, перемешивают и разливают в чашки Петри с последующим засеванием суточной бульонной культурой гемолитического штамма стафилококка, инкубируют при 37°С и на другой день устанавливают наличие или отсутствие гемолиза, указывающего на отсутствие или наличие антител, защищающих эритроциты от гемолиза.

Методика выявления антител, защищающих эритроциты от гемолиза, а также зависимость между уровнем антител к эритроцитам и устойчивостью эритроцитов к гемолизу микроорганизмами, была отработана на стандартной гемолитической сыворотке к эритроцитам барана.

Для постановки реакции брались эритроциты барана, питательный агар, гемолитические штаммы различных стафилококков и стандартная кроличья гемолитическая сыворотка с титром 1:1500.

Расплавленным и остуженным до температуры 45°С питательным агаром делались разведения сыворотки от 1/50 до 1/800 в объеме 20 мл (методом серийных разведений), вносились отмытые эритроциты барана до концентрации 3%, все тщательно перемешивалось и выливалось в чашку Петри.

После застывания и подсушивания чашек на них методом штриха засевалась суточная бульонная культура стафилококков. После инкубирования при температуре 37°С на другой день учитывался результат: отсутствие или наличие гемолиза. Если регистрировалось наличие гемолиза, то антитела отсутствовали в данном разведении сыворотки. Если гемолиза не было, то в данном разведении находилось достаточное количество антител для защиты эритроцитов от гемолиза.

Контролем служили такие же посевы на чашки, но с нормальной кроличьей сывороткой, поскольку гемолитические сыворотки готовятся путем иммунизации кроликов эритроцитами барана, чтобы быть уверенными, что ингибирующее действие сыворотки заключается не в белках сыворотки.

Результаты опытов представлены в таблице 1.

Таблица 1
Титр антител в геополитической сыворотке, препятствующих гемолизу эритроцитов гемолизинами различных штаммов стафилококковТест-штаммы стафилококковРазведения сыворотки1:501:1001:2001:400опытконтрольопытконтрольопытконтрольопытконтроль18+-+-----15+-+-----Р-109+-+-----Жаев+-+-----472+-+-+/----Примечание: (+) - наличие защитного действия сыворотки;(-) - отсутствие защитного действия сыворотки.

Как видно из таблицы 1, иммунная гемолитическая сыворотка с титром антител 1:1500, выявленных предлагаемой методикой, защищает гомологичные эритроциты в разведении до 1:100.

Проверка нормальных кроличьих (контрольных) сывороток на содержание антител, защищающих эритроциты барана от лизиса их гемолизином стафилококков, по этой же методике не выявила их в сыворотке даже в меньшем разведении ее (таблица 2).

Таблица 2.
Результаты титрования нормальной кроличьей сыворотки на наличие антител, препятствующих гемолизу эритроцитов гемолизинами различных штаммов стафилококковТест-штаммы стафилококковРазведения сыворотки1:51:101:201:4018----15----Р-109----Жаев----472----Примечание: (+) - наличие защитного действия сыворотки;(-) - отсутствие защитного действия.

Как видно из таблицы 2, нормальная кроличья сыворотка в разведении 1:5 не обладает защитным действием в отношении бараньих (гетерологичных) эритроцитов, взятых в большей концентрации, чем в основном опыте, и, следовательно, не может тормозить гемолиз эритроцитов в предыдущем опыте.

Определение уровня аутоантител в сыворотке крови больных и здоровых людей проводилось аналогично.

У доноров на станции переливания крови брались остатки от «пилотной» крови, то есть небольшого количества крови, забираемого параллельно с основным количеством для определения ее состояния (с антикоагулянтами, поэтому кровь не свертывалась и сыворотка не могла быть получена). Кровь разливалась в центрифужные пробирки и центрифугировалась. Исследование в данном случае проводилось с плазмой крови.

Расплавленным и остуженным до температуры 45°С питательным агаром делались разведения плазмы от 1/5 до 1/80 в объеме 20 мл (методом серийных разведений), вносились отмытые эритроциты больного до концентрации 3%, все тщательно перемешивалось и выливалось в чашку Петри.

После застывания и подсушивания чашек на них методом штриха засевалась суточная бульонная культура стафилококков. После инкубирования при температуре 37°С на другой день учитывался результат: отсутствие или наличие гемолиза. Если регистрировалось наличие гемолиза, то аутоантитела отсутствовали в данном разведении сыворотки. Если гемолиза не было, то в данном разведении находилось достаточное количество аутоантител для защиты эритроцитов от гемолиза.

Контролем служили посевы на питательную среду в чашках Петри только с теми же эритроцитами, но без плазмы, где вокруг колоний стафилококка происходил гемолиз. Контроль берется для того, чтобы быть уверенными, что гемолитический штамм микроорганизма «работает», то есть вызывает гемолиз.

При исследовании сывороток больных аутоиммунной гемолитической анемией поступали следующим образом. У больных из вены в пробирку отбиралась кровь, помещалась на 2 часа в термостат для свертывания. Затем пастеровской пипеткой обводился сгусток для отделения его от стенок пробирки и кровь помещалась до следующих суток в холодильник для ретракции сгустка (по общепринятой методике).

Отсасывалась сыворотка, сгусток встряхивался стерильным пинцетом для высвобождения необходимого количества эритроцитов и удалялся. Эритроциты отмывались стерильным физиологическим раствором.

Расплавленным и остуженным до температуры 45°С питательным агаром делались разведения от 1/20 до 1/320 в объеме 20 мл (методом серийных разведений), вносились отмытые эритроциты больного до концентрации 3%, все тщательно перемешивалось и выливалось в чашку Петри.

После застывания и подсушивания чашек на них методом штриха засевалась суточная бульонная культура стафилококков. После инкубирования при температуре 37°С на другой день учитывался результат: отсутствие или наличие гемолиза. Если регистрировалось наличие гемолиза, то аутоантитела отсутствовали в данном разведении сыворотки. Если гемолиза не было, то в данном разведении находилось достаточное количество аутоантител для защиты эритроцитов от гемолиза.

Контролем служили посевы на питательную среду в чашках Петри только с теми же эритроцитами, но без сыворотки. Если в контрольных посевах наблюдался гемолиз, то учитывался результат в опыте.

Положительный пример 1

Определялся средний уровень антиэритроцитарных аутоантител плазмы здоровых лиц - доноров в отношении собственных гомологичных эритроцитов для того, чтобы выявить норму (уровень антиэритроцитарных аутоантител крови практически здоровых людей). Всего было обследована плазма крови 20 человек. Максимальное разведение плазмы, которая тормозила гемолиз собственных эритроцитов, оказалось 1:17,5.

Положительный пример 2.

Была определена концентрация аутоантител к эритроцитам в сыворотках 18 больных аллергозами различной этиологии в сравнении с сыворотками такого же количества практически здоровых лиц. Уровень антиэритроцитарных аутоантител сывороток крови больных аллергозами (среднее значение разведения 1:21,5) оказалось несколько выше такового у практически здоровых лиц. Это подтверждает данные литературы о повышении уровня аутоантител у больных различными видами аллергозов.

Более отчетливые результаты выявлены при исследовании сывороток больных аутоиммунной гемолитической анемией.

Положительный пример 3.

У шести больных аутоиммунной гемолитической анемией определялся уровень антиэритроцитарных антител аналогично вышеописанной методике.

Уровень аутоантител сывороток крови этих категорий больных оказался равен 1:80, что превышает средний уровень у здоровых в четыре с лишним раза (1:17,5).

Таким образом, эта реакция может служить дополнительным, простым и доступным методом оценки иммунного статуса здоровых или больных. Кроме того, она позволяет судить о состоянии (защитном действии) донорской крови или плазмы в отношении гемолитических микроорганизмов.

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а именно к гематологии и иммунологии. Для осуществления способа готовят различные разведения сыворотки обследуемого больного в питательном агаре. Вносят отмытые эритроциты больного до концентрации 3%, перемешивают и разливают в чашки Петри с последующим засеванием суточной бульонной культурой гемолитического штамма стафилококка, инкубируют при 37°С. На другой день устанавливают наличие или отсутствие гемолиза, указывающего на отсутствие или наличие антител, защищающих эритроциты от гемолиза. Использование способа позволяет повысить точность и доступность выявления антител, защищающих эритроциты от гемолиза, что, в свою очередь, позволяет оценить иммунный статус обследуемого пациента. 2 табл.

Способ выявления антител, защищающих эритроциты от гемолиза, отличающийся тем, что готовят различные разведения сыворотки обследуемого больного в питательном агаре, вносят отмытые эритроциты больного до концентрации 3%, перемешивают и разливают в чашки Петри с последующим засеванием суточной бульонной культурой гемолитического штамма стафилококка, инкубируют при 37°С и на другой день устанавливают наличие или отсутствие гемолиза, указывающего на отсутствие или наличие антител, защищающих эритроциты от гемолиза.