СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЛЕПТОСПИР Российский патент 2009 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к производству биопрепаратов и может быть использовано при изготовлении вакцин против лептоспироза сельскохозяйственных животных, а также в других областях биотехнологии, где требуются значительные объемы культур микроорганизмов LEPTOSPIRA.

Разработано значительное количество способов для получения культуральной жидкости, использующих биореакторы различных конструкций и технологические схемы, обеспечивающие нужную концентрацию микробных клеток, предотвращения контаминации, сохранения антигенных и других свойств культур лептоспир (1).

Для достижения определенных условий выращивания и предотвращения загрязнений, как матровых расплодок, так и производственных расплодок лептоспир, требуется включать в технологическую схему различные дополнительные фильтрующие устройства для увеличения надежности проведения процессов культивирования с целью предотвращения контаминации и получения качественной культуральной жидкости, соответствующей необходимым параметрам.

Известен способ очистки лептоспир от посторонней микрофлоры, основанный на способности лептоспир, находящихся в жидкой культуральной среде, проходить сквозь стерилизующие мембранные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. Способ предусматривает наличие емкости, содержащей лептоспиру, фильтрующего элемента с диаметром пор 0,2 мкм, приемной емкости для сбора культуры. Известный способ имеет ряд недостатков в отношении применимости к большим объемам культуральной жидкости, в ряде случаев по качественным показателям, и ведет к значительным потерям основной массы клеток лептоспир из-за ухудшения проходимости фильтрующих материалов. Также разработан метод выращивания (культивирования) лептоспир в реакторах или стеклянных баллонах (2).

Целью настоящего изобретения является улучшение качества культуры лептоспир, сокращение случаев появления посторонней микрофлоры в производственных расплодках лептоспир и увеличение эффективности производства.

В предлагаемом способе культивирования лептоспир использована способность лептоспир проходить сквозь фильтрующие элементы с диаметром пор 0,2 мкм. Эта способность позволяет объединить процесс засева матровой культуры с ее очисткой на фильтрэлементе и стерилизацию среды для выращивания, что значительно увеличивает надежность процесса культивирования за счет исключения ряда промежуточных технологических операций, способных являться потенциальным источником заражения производственного материала.

Условно схема проведения процесса культивирования изображена на Фиг.1. Сущность предлагаемого способа состоит в следующем: питательная среда на основе сыворотки крови животных доноров (5-7%) и фосфатного буфера с рН 7,2-7,4 (93-95%), а также необходимые факторы роста смешиваются в емкости 1 (биореактор). Оптимальными биохимическими показателями среды для выращивания являются 0,22-0,3 мг% белка и рН 7,3-7,6. В емкость (биореактор) 3 среда попадает, пройдя предварительную (грубую) очистку на фильтрующих элементах с диаметром пор 0,45 мкм (фильтрующий элемент 2). В реактор 3 (промежуточная емкость) также подается матровая расплодка лептоспир из емкости 4 в объеме, составляющем 10% от объема засеваемой среды. После перемешивания полученная смесь под давлением подается в емкость 6 через фильтрующий элемент 5 с диаметром пор 0,2 мкм. На этом этапе происходит микрофильтрация среды для удаления возможных загрязнений, в том числе и микробного происхождения, из среды выращивания, клетки лептоспир при этом проходят через фильтрующий элемент с незначительными потерями. Очищенная смесь попадает в приемник (реактор) 6 или серию приемников (баллоны) для дальнейшего выращивания до получения необходимой концентрации лептоспир.

При таком способе засева питательной среды сокращается общее время выращивания, так как стадия адаптации культуры к питательной среде совмещена с процессом конечной очистки среды. Кроме того, данный метод позволяет практически исключить или значительно сократить количество выращиваний, загрязненных посторонней микрофлорой, так как основным потенциальным источником загрязнения является стадия внесения матровой культуры в предварительно стерилизованную питательную среду.

Гидродинамические характеристики, возникающие в процессе прохождения матровой культуры в среде для выращивания через мембранные фильтрующие элементы, создают условия для получения более морфологически однородной партии производственной культуры, так как через поры мембраны, как правило, могут пройти клетки, находящиеся в определенной фазе роста. Кроме того, наблюдается определенная активизация культуры лептоспир, выраженная в более интенсивном делении клеток.

Способ апробирован на Армавирской биофабрике при помощи шести производственных штаммов лептоспир: Гриппотифоза (ВГНКИ-1), Иктерогеморрагия (ВГНКИ-2), Каникола (ВГНКИ-3), Тарассови (ВГНКИ-4), Харджио (ВГНКИ-5), Помона (ВГНКИ-6).

ЛИТЕРАТУРА

1. Авторское свидетельство №2088258 кл. А61К 39/08, Способ изготовления вакцины против лептоспироза животных.

2. RU 2096042 С1, 20.11.1997.

Способ культивирования лептоспир предусматривает предварительную очистку питательной среды на основе сыворотки крови животных на мембранах с диаметром пор 0,45 мкм. Обработанную таким образом питательную среду объединяют с матровой культурой лептоспир, вносимой в количестве 10% от объема среды, и подвергают стерилизующей фильтрации на мембранах с диаметром пор 0,2 мкм совместно с матровой культурой лептоспир. Полученную смесь направляют на доращивание культуры до достижения необходимой концентрации лептоспир. Это обеспечивает улучшение качества культуры лептоспир, сокращение случаев появления посторонней микрофлоры в производственных расплодках и увеличение эффективности производства. 1 ил.

Способ культивирования лептоспир путем приготовления питательной среды на основе сыворотки крови животных, стерилизующей фильтрации на мембранах с диаметром пор 0,2 мкм, внесения матровой культуры лептоспир и последующего выращивания до достижения необходимой концентрации лептоспир, отличающийся тем, что питательную среду сначала очищают микрофильтрацией на мембранах с диаметром пор 0,45 мкм, а стерилизующую фильтрацию питательной среды на мембранах с диаметром пор 0,2 мкм проводят совместно с матровой культурой, вводимой в количестве 10% от объема среды.