Штамм базидиального гриба CopRINUS DомеSтIсUS (FR)GRaY ВКМ F 2459 Д - продуцент фибринолитических и тромболитических ферментов. Советский патент 1991 года по МПК C12N15/00 C12N9/50 C12N15/00 C12R1/645 

гнческим заболеваниям людей, кроме того, ферменты тромболитического дей ствия из м/о оказывают ряд побочных эффектов fia живой организм, что также ограничивает их использование. Известно применение в качестве источника тромболитических и фибринолитических ферментов плодовых тел базидиального гриба Tricholoma рогtentosum (Fr) Quel, собранных в местах естественного произростания. Однако неравномерная доступность исходного сырья и зависимость плодообразования гриба от ряда биологически факторов ограничивают использование этого продуцента для выделения из не го тромболитических ферментов. В связи с этим большой интерес представляют культуры высших базидиальных грибов (среди которых имеется большая группа съедобных), произрастание которых в искусственных услови ях является регулируемым процессом, причем мицелий этих грибов не имеет спороношения, что исключает опасность соответствующих заболеваний. Известен способ получения тромбол тического фермента из культуры базидиального гриба Armillaria mellea . Способ характеризуется сложным, мног ступенчатым методом вьщеления внутри клеточного фермента из мицелия гриба Известен штамм базидиального гриба Flqmmulina velutipes (Fr)Karst., N0385 (хранится в коллекции лаборатории биохимии грибов Ботанического института им. В.Л.Комарова АН СССР), продуцент внеклеточных тромболити- ческих и фибринолитических ферментов , Максимальная тромболитическая активность (ТА) культурального фильтрата (КФ) составляла 9-10 ч инаступа ла на 6-7 сутки выращивания гриба. Тромболитический препарат, полученны из КФ, лизировал тромбы крови за 2ч, имел фибринолитическую активнос .(ФА) 15 тыс., фибриногенолитическ5то активность (ФгА) 1:250 и сопутствующую молокосвертывающую (МСА) и казеиназную активность (КА) 60 ед. и 0,1 ед. соответственно. Выход препарата составлял 100 мг с 1 л КФ. Целью изобретения является новый штамм базидиального гриба Coprinus domesticus (Fr) Gray - продуцент тромболитических и фибринолитических ферментов. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов (11нститут биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР, Пущино на Оке) и имеет регистрационный № BKMf 2459 Д. Новый штамм имеет следующие культурально-морфологические и физиологобиохимические признаки. Культурально-морфологические признаки. Культура Coprinus domesticus поддерживается на косяках суслоагара (сусло 4 по Баллингу, агар 20%), хранится в рефрижераторе при +412°С или под слоем стерильного вазелинового масла при комнатной температуре, имеет при этом следующие микроскопические признаки - мицелий белый, с возрастом серовато-коричневатый, обратная сторона колонии гладкая, агар не окрашен. Чашки Петри полностью зарастают мицелием на 11-13 сутки роста. Микроскопические признаки - мицелий состоит из двух типов гиф - широкие 3-5 мкм в диаметре и тонкие генеративные, около 2 мкм. Пряжки встречают ся регулярно на генеративных гифах. Характерным признаком этой культуры является обильное образование склероциев. В течение всего периода развития гриба он остается на вегетативной стадии и не образует органов спороношения. Физиолого-биохимические признаки. Культура гриба интенсивно развивается при 26-28°С. Активно синтезирует фибрино- и тромболитические ферменты на средах с органическими источниками азота и углерода на фоне минеральных солей (калий фосфорно-кислый одно- и двузамещенный, сернокислые магний, марганец, цинк, железо, хлористые натр и калий). Биосинтез ферментов стимулируется солодоворостковым и кукурузным экстрактами. Coprinus domesticus - культура дереворазрушающего гриба, относится к возбудителям бурой гнили древесины, дает отрицательный тест на реакцию Бавендамма на среде с таннином. Штамм-продуцент выращивают глубинно в Колбах на 0,5 л, содержащих 100 мл питательной среды, при на качалке при 130-160 об/мин. Посевной материал вносят в виде суспензии (измельченная пленка мицелия) в количестве 10% от объема среды. Для посевного материала и для культивирования гриба .используют питательную среду следующего состава, г/л: глюкоза

10, пептон 2,5; . 0,6; . 0,4; MgS04-7H2.0 0,05; NaCl 0,5; CaCl 0,05; FeS04 0,005; ZnS04 0,001; MnSO 0,003; солодово-ростковый экстракт 0,1% (по сух. весу), вода водопроводная до 1 л, рН среды после стерилизации 6,0-6,2, При выращивании в указанных условиях максимальная ТА достигается на 6 сутки.

Мицелий отделяют от КФ фильтрованием и в КФ определяют ТА. У С. domesticus она составляет 5-6 ч (табл.1).

Как видно из таблицы, тромболитическая активность в КФ Coprinus doraesticus по усредненным данным в 2,2 раза выше чем в КФ Flaramulina velutipes.

Тромболитический препарат из КФ С. domesticus получают ме-лодом депигментации на анионообменнике ФАФ с последующим дробным осаждением этанолом (при -20°С) в соотношении 1:1 и 1:3. Ферментативная активность препарата: ТА 2 ч, ФА 15 тыс., ФгА 1:1024. Балластная сопутствукидая МСА 16,5 ед., КА 0,1 ед. Выход препарата Составляет 140-150 мг с 1 л КФ (табл. 2).

Таким образом препарат из С. domesticus сохраняет высокую специфическую активность (ТА, ФА, ФгА), причем ФгА в новом препарате в 4 раза выше, а балластная МСА в 3,6 раза ниже по сравнению с препаратом из F. velutipes. Выход препарата увеличивается на 40-50%.

Указанные активности определяют общепринятыми методами: ТА (в ч) по методу Имшенецкого и Броцкой, расчет в ед. по Псурцевой, Денисовой, ФА по методу Аструпа и Нюллертца, ФгА по Эстеоло, МСА и КА по (13), фибринолиз in vivo по (14), тромболизис in vivo. Ферментативные активности рассчитаны на 1 мг белка.

Ферментные препараты из С. dome- . sticus и F. velutipes сравнивались в опытах in vivo при изучении процессов фибринолиза и тромболиза.

Таким образом, в опьгтах in vivo при введении препаратов из С. domesticus (в дозах в 3 раза меньшей) достоверно подтверждено увеличение фибринолиза животных через 5 мин на 424% (по Ковальскому) и на 40%

(по Аструпу) и через 30 мин соответи ственно на 30 и 20%.

Результаты испытаний на способность лизировать тромбы, искусственно созданные в кровеносном русле животных, представлены в табл. 4.

Данные табл. 4 свидетельствуют о достоверном превосходстве тромболитического препарата из нового штамма С. domesticus - его введение в дозб, меньшей в 3 раза, обеспечивает практически полное рассасывание тромбов (99,5%).

-Преимуществами предлагаемого нового штамма Coprinus domesticus BKMf № 2459 Д являются.;,

способность шт мма продуцировать тромболитические ферменты в КФ с активностью в 2,2 раза выше чем в КФ F. velutipes;

возможность увеличения выхода препарата в 1,5 раза;

наличие в новом препарате ФгА в

4 раза более высокой, а балластной МСА в 3,6 раза более низкой чем в препаратах из F. velutipes;

препарат из КФ С. domesticus в дозе, в 3 раза меньшей чем препарат

из КФ F. velutipes, обеспечивает достоверное увеличение фибринолиза животных через 5 мин на 424% (по Ковальскому) и на 40% (по Аструпу) и через 30 мин на 30 и 20% соответственно;

препарат из КФ С. domesticus в дозе, в 3 раза меньшей чем препарат из КФ F. velutipes, обеспечивает практически полное рассасывание внутренних

тромбов (99,5%).,

Промышленное куль тивирование базидиомицетов, в том числе штамма С. domesticus (Fr) Gray BKMf 2459 Д, может осуществляться на любом оборудовании микробиологических производств, предназначенном для выращивания м/о. Производственные помещения при этом свободны от спороносящего материала .

Использование базидиальных грибов в качестве продуцентов фибрино- и тромболитических ферментов открывает новую сырьевую базу для их получения и расширяет существующий.узкий ассортимент этих остро необходимт пс медицине ферментов. П F С Сравнительная характеристика ферментативной активности в КФ при культивировании грибов Coprinus domesticus и Flaramulina velutipes Вид гриба Возраст ТромболитиFlammulina velutipes 6 9 83 Coprinusdomesticus6 6 150 я характеристика тромболитических препаратов, полученных . , ибов Coprinus domesticus и Flaramulina velutipes Выход,мгФерментативная активность (с 1 л КФ) специфическаясопутствунлцая ТА, ч ТА, ед. j ФА,ед. | ФгА,ед. |мСА,ед. КА,ед. 100- 2 550 15 тыс. 1:250 60 0,1 140-150 636-550 15 тыс. 1:1024 16,5 0,1 Сравнительная характеристика фибринолиза у животных после внутривенного введения препаратов из Coprinus domesticus и Flammulitia velutipes Препараты Концентра- Фибринолиз, % Контроль, интактные животные Физ. р-р 100 100 Flammulina velutipes0,5 через 5 мин276 230 через 30 мин190 140 Coprinus domesticus0,15 через 5 мин700 270 через 30 мин220 160 Достоверность: р 0,01. Таблица1 культуры, ческая аксут. тивность Г- ч I ед. ,7 10 70 ,7 5 190 Таблица 2 Т а б л л ц а 3 ция, % -т по Коваль- по Астскому РУпу

911377621

Сравнительная характернстика тромболиэиса у животных после внутривенного введения препаратов из Coprinus domesticus и Flammulina velutipes

Т а б л н ц а 4

Штамм базидиального гриба Coprinus domesticus (Fr) Gtay (Всесоюзная коллекция микроорганизмов ИБФМ АН СССР, коллекционный номер BKMf 2459 Д) - продуцент фибринолитических и .тромболитических ферментов. (Л со vj СП) tsD тов патогенных микроорганизмов (м/о) из рода Streptococcus и непатогенных м/о, например плесневых грибов р. Aspergillus и др. Однако использование как патогенной, так и непатогенной микрофлоры имеет серьезный недостаток, связанный с природой эТих организмов они спороносят в культуре, что способствует профессиональным и аллср

A StOxlO 0% 6.9% 837б%

Достоверность; ,05.

Oj,02tO,t001.S 9975%