СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИКОПЛАЗМОЗНЫХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ СЫВОРОТОК ДЛЯ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ПУТЕМ ГИПЕРИММУНИЗАЦИИ КРОЛИКОВ Российский патент 2009 года по МПК A61K39/395 C12P21/00 G01N33/569 C12R1/35 

Способ получения микоплазмозных сывороток для реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) относится к методам лабораторной диагностики микоплазмозов и может быть использован в ветеринарной медицине.

Известны способы получения гипериммунных сывороток при бруцеллезе, лептоспирозе животных, описанные в рефератах российских патентных документов за 1994-2007 гг. (№№2173169, 1999.07.27; 2138292, 1998.10.13).

Однако данные способы обладают следующими недостатками: длительные сроки гипериммунизации; невысокие титры образующихся в крови кроликов антител и низкая активность полученных сывороток.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения диагностических сывороток путем гипериммунизации кроликов, используемых в РНИФ для диагностики микоплазмозов плотоядных (Новикова Н.Н. Экспресс-методы диагностики ассоциативного урогенитального микоплазмоза плотоядных: дис… канд. вет. наук.: 16.00.03. / Н.Н.Новикова; - Новосибирск - 2002. - С.55-60).

Суть этого способа состоит в следующем.

Для гипериммунизации используются трехсуточные культуры микоплазм, выделенные от плотоядных (M.fermentans, M.canis, M.laidlawii, U.urealyticum). Культуральную жидкость центрифугируют при 6 тыс. оборотах /мин в течение часа. Осадок после трехкратного ресуспендирования в физиологическом растворе и последующего центрифугирования доводят до концентрации 1,7 млрд микробных тел в 1 мл по бактериальному стандарту мутности.

Гипериммунизацию микоплазмами проводят на 8 кроликах (по 2 головы на каждый штамм) весом 2,5-3 кг. Суть гипериммунизации состоит в дробном внутривенном введении антигена кроликам каждые три дня с двукратным применением иммуностимулятора левомизола подкожно.

Таблица 1. Схема гипериммунизации кроликов культурамимикоплазм. Время введения, сут 1 4 7 10 13 16 20 24 Доза антигена, млрд м.т. 0,85 1,7 1,7 1,7 3,4 3,4 3,4 3,4 Левамизол, мл 1 1 - - - - - -

Динамику синтеза антител изучают на 7, 14, 21 и 30 сутки после первого введения антигена в реакции непрямой иммунофлюоресценции, которую ставят на предметных стеклах по стандартной методике, учет реакции проводят в крестах, свечение менее чем на два креста считают отрицательным. В качестве антигенов в РНИФ применяют 1 млрд взвеси микоплазм, инактивированных на водяной бане при 70°С - 30 мин. На 30-е сутки всех кроликов тотально обескровливают и получают микоплазмозные диагностические сыворотки.

Таблица 2. Динамика синтеза антител у кроликов, гипериммуникультурами микоплазм. Сроки взятия крови(дни) Титр антител 7-й день 1:40 14-й день 1:160 21-й день 1:320 30-й день 1:640

Наиболее высокий уровень антител регистрируется на 21-30 дни после гипериммунизации, который колеблется в пределах 1:320-1:640.

Целью изобретения является получение микоплазмозных диагностических сывороток путем гипериммунизации кроликов для диагностики микоплазмозов свиней в реакции непрямой иммунофлуоресценции.

Поставленная цель достигается при соблюдении ряда приемов: получением антигенов из трех культур микоплазм (М.hyosynoviae, M.hyorhinis и Ureaplasma sp.); гипериммунизацией кроликов в течение 21 дня путем дробного внутривенного введения антигенов каждые три дня с трехкратным применением иммуностимулятора левомизола.

Описание метода

Для гипериммунизации кроликов используются трехсуточные инактивированные нагреванием до 70°С в течение 30 минут культуры микоплазм (штаммы М.hyosinoviae, М.hyorhinis и Ureaplasma sp.), которые отмывали от питательной среды путем центрифугирования при 6000 об. 30 мин, осадок после трехкратного ресуспендирования и последующего центрифугирования разводили до концентрации 1,7 млрд микробных клеток в 1 мл по бактериальному стандарту мутности (ГИСК им. Л.А.Тарасовича).

Иммуностимулятор левамизол вводили трехкратно для повышения иммуногенности вводимых штаммов микоплазм и сроки гипериммунизации сократили до 21-х суток в связи с максимальным титром антител в крови кроликов на 21-е сутки. В дальнейшем титр антител в крови кроликов начинает снижаться.

Таблица 3. Схема гипериммунизации кроликов культурами микоплазм. Время введения, сут 1 4 7 10 13 16 19 Доза антигена, млрд м.т. 0,85 1,7 1,7 1,7 3,4 3,4 3,4 Левамизол, мл 1 1 1 - - - -

Динамику синтеза антител изучали на 7,14 и 21 сутки после первого введения антигена в реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ). На 21-е сутки всех кроликов тотально обескровливали и получали микоплазмозные диагностические сыворотки.

При постановке РНИФ была использована следующая методика. На тщательно обезжиренные без царапин предметные стекла наносили пастеровской пипеткой параллельно друг другу несколько капель антигенов. Антигены высушивали и фиксировали над пламенем спиртовки. Затем на каждую каплю антигена наносили такую же каплю сыворотки, начиная с последнего разведения. Стекла выдерживали во влажной камере при 37°-38°С в течение 50-60 мин для образования комплекса антиген - антитело. После чего их промывали от несвязавшихся антител дистиллированной водой, подсушивали и наносили в красящем титре (подобранным опытным путем) ослиный антикроличий глобулин меченный ФИТЦ (флуоресцеин изотиоционатом натрия), изготовленный НИИ ЭМ им. Н.Ф.Гамалеи. Затем стекла помещали на 15-20 минут во влажную камеру при температуре 37°-38°С. По истечении этого времени мазки промывали дистиллированной водой, просушивали и просматривали в люминесцентном микроскопе с обязательными контролями.

1. Антиген + сыворотка положительная + сыворотка люминесцентная;

2. Антиген + сыворотка отрицательная + сыворотка люминесцентная;

3. Антиген + физиологический раствор + сыворотка люминесцентная.

Микроскопию проводили в падающем свете микроскопа МБИ-15.

Для оценки интенсивности свечения использовали четырехкрестовую систему:

++++ - очень яркая люминесценция по периферии микробной клетки, четко контрастирующая с телом клетки; +++ - яркая люминесцирующая периферия клетки; ++ или + - слабое свечение периферии клетки; - (минус) люминесценция клеток отсутствует. За положительный результат принимали яркое специфическое свечение контуров микробов в виде ободков с оценкой в 3 и 4 креста; сомнительные результаты оценивали в 2 креста при наличии слабого свечения контуров клеток.

Таблица 4. Динамика синтеза антител у кроликов, гипериммунизированных культурами микоплазм. Сроки взятия крови (дни) Титр антител М.hyosynoviae M.hyorhinis Ureaplasma sp. 7-й день 1:20 1:10 1:20 14-й день 1:640 1:640 1:320 21-й день 1:640 1:1280 1:640

Установлено, что на 7-й день после первого введения антигена антитела в РНИФ выявлялись в низких титрах 1:10-1:20. На 14-й день положительная реакция в РНИФ была при более высоких разведениях в пределах 1:320-1:640, а на 21-е сутки синтез антител достиг максимального уровня 1:640-1:1280.

Преимущество данного способа получения противомикоплазмозных сывороток в более высоких диагностических титрах антител, в сокращении сроков гипериммунизации и в возможности использования полученных сывороток для диагностики микоплазмозов свиней в РНИФ. Контроль на видовую специфичность и активность полученных микоплазмозных сывороток в РНИФ.

Для изучения видовой специфичности и активности использовали кроличьи антимикоплазмозные сыворотки в разведениях с 1:10 до 1:640 и микоплазмозные антигены, полученные вышеописанным способом.

Определяя видовую специфичность и активность полученных микоплазмозных кроличьих сывороток в РНИФ, установили, что полученные сыворотки реагируют только с аналогичными антигенами и активны во всех используемых разведениях.

Изобретение касается получения микоплазмозных диагностических сывороток для диагностики микоплазмозов свиней в реакции непрямой иммунофлуоресценции. Способ предусматривает использование антигенов из трех культур микоплазм - Mycoplasma hyosynoviae, M. hyorhinis и Ureaplasma sp.Б которые используют для гипериммунизации кроликов в течение 21 дня путем дробного внутривенного введения антигенов каждые три дня с трехкратным применением иммуностимулятора левомизола. Динамику синтеза антител изучают на 7, 14 и 21 сутки после первого введения антигена в реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ). Постановка реакции проводится по общепринятой методике. Для оценки реакции используют четырехкрестовую систему. Установлено, что на 7-й день после первого введения антигена антитела в РНИФ выявлялись в низких титрах 1:10-1:20. На 14-й день положительная реакция в РНИФ была при более высоких разведениях в пределах 1:320-1:640, а на 21-е сутки синтез антител достиг максимального уровня 1:640-1:1280. Использование способа обеспечивает получение противомикоплазмозных сывороток в более высоких диагностических титрах антител, сокращение сроков гипериммунизации и возможность использования полученных сывороток для диагностики микоплазмозов свиней в РНИФ. 5 табл.

Способ получения микоплазмозных диагностических сывороток для диагностики микоплазмозов свиней в реакции непрямой иммунофлуоресценции путем гипериммунизации кроликов антигенами, полученными из трех культур микоплазм, с предусмотренным по схеме введением иммуностимулятора левомизола и изучением динамики синтеза антител на 7-е, 14-е и 21-е сутки, отличающийся тем, что в качестве антигенов используются инактивированные нагреванием при 70°С в течение 30 мин штаммы микоплазм, выделенных от свиней, Mycoplasma hyosynoviae, Mycoplasma hyorhinis и Ureaplasma species, по схеме иммуностимулятор левамизол вводят трехкратно и сроки гипериммунизации сокращают до 21 суток в связи с максимальным титром антител против вводимых микоплазмозных антигенов в крови кроликов на 21-е сутки.