Бактериальный lux-биосенсор на основе промотора гена бактериальной ДНК-полимеразы II Российский патент 2024 года по МПК C12N15/63 C12N15/70 G01N21/76 

Изобретение относится к экологии, токсикологии и фармацевтике. Позволяет исследовать механизмы токсичности веществ и смесей, детекцию ДНК повреждающих агентов в среде. Данное изобретение позволяет по увеличению уровня биолюминесценции судить об активации транскрипции индуцируемого в ответ на повреждения ДНК промотора ДНК-полимеразы И. Lux-биосенсор представляет из себя клетки Escherichia coli с гибридными плазмидами, содержащими lux-гены под контролем промотора гена «SOS-ответа». Биосенсорные клетки способны специфично увеличивать уровень биолюминесценции за счет усиления транскрипции lux-генов при алкилировании ДНК или возникновении повреждений ДНК, вызывающих остановку репликационной вилки.

На данный момент есть два подхода к исследованиям химических соединений на токсичность с помощью люминесцирующих бактерий: наблюдение за снижением уровня общей люминесценции [1]-[3] или наблюдение за индукцией люминесценции [4]-[13]. В экспериментах с индукцией биолюминесценции используются стресс-индуцируемые lux-биосенсоры, полученные методом генной инженерии. Данные клетки содержат в себе генетическую конструкцию с репортерными генами люминесценции под контролем регуляторных элементов, а именно, специфично индуцируемых промоторов. Таким образом, можно получить lux-биосенсоры, специфично реагирующие на различные типы клеточного стресса, к примеру, на повреждение ДНК, тепловой стресс, окислительный стресс и др. [7]. На данный момент существуют целый ряд биосенсоров, индуцирующихся в ответ на повреждения ДНК. Например, в работе [14] были сконструированы следующие конструкции для детекции различных типов ДНК повреждений, а именно: 1) ДНК дефекты, останавливающие репликацию и индуцирующие классический SOS-ответ, 2) «каскадный» тип SOS-ответа и 3) алкилирование азотистых оснований ДНК. Для того, чтобы расширить список существующих биосенсоров на повреждение ДНК была получена новая генетическая конструкция на основе промотора к гену II ДНК-полимеразы Escherichia coli. В предлагаемом изобретении мы представляем новый биосенсор, содержащий данную генетическую конструкцию.

Техническим результатом изобретения являются клетки Е. coli, позволяющие определять ДНК-повреждающие агенты, вызывающие остановку репликационной вилки или алкилирование азотистых оснований.

Поставленная задача решается, а технический результат достигается благодаря бактериальному биосенсору Е. coli pDinA-lux, полученному путем трансформации клеток Е. coli биосенсорной плазмидой с генами luxCDABE под контролем промотора к гену полимеразы II, специфически увеличивающий уровень своей люминесценции в ответ на повреждения ДНК.

Это дополняет существующий список lux-биосенсоров, детектирующих повреждение ДНК, а также может позволить изучать механизмы индукции экспрессии гена polB (dinA) (полимераза II) в клетках Е. coli. Измерения проводятся на клетках, выращенных в жидкой среде Lysogeny Broth (LB), требуют навыков ведения бактериальной культуры и физического прибора для измерения люминесценции.

Задача решена путем конструирования биосенсорной плазмиды, содержащей гены luxCDABE Photorhabdus luminescens, определяющие люминесценцию, под контролем промотора P_dinA Е. coli. В векторную плазмиду pDEW201 [15] перед генами люминесценци был клонирован промотор P_dinA. Фрагмент ДНК, кодирующий данный промотор, был получен амплификацией на матрице хромосомальной ДНК E. coli MG1655 с помощью следующих праймеров:

Полученная плазмида была названа pDinA-lux. Данной плазмидой были трансформированы клетки Е. coli. Таким образом, был получен биосенсор Е. coli pDinA-lux.

Методика исследований с помощью lux-биосенсора в общем виде.

Методика исследования биологически активных веществ с помощью нового lux-биосенсора требует проведения следующих операций:

1. Приготовление биосенсора к измерениям;

- выращивание биосенсорных клеток в жидкой среде LB с добавлением ампициллина в концентрации 200 мкг/мл при температуре 37°С при постоянном перемешивании до экспоненциальной фазы роста с OD ≈ 0,1;

- отбор аликвот клеточной культуры по 180 мкл и распределение их по кюветам или лункам планшета.

2. Добавление к пробам исследуемых образцов в различных концентрациях;

- приготовление отрицательного и положительных контролей. В качестве отрицательного контроля используется дистиллированная вода. В качестве положительного контроля используются: митомицин С (MitC) в концентрации 10 мкМ (конечная концентрация в пробе) и метилметансульфонат (MMS) в концентрации 100 мкМ (конечная концентрация в пробе);

- добавление по 20 мкл исследуемых образцов в разных разведениях к каждой пробе биосенсора.

3. Кинетику люминесценции от времени следует измерять на протяжении 4,5-5 часов при комнатной температуре.

4. Обработка полученных результатов. Полученные графики на исследуемых образцах или значения люминесценции в конечной точке сравнивают с контрольными образцами.

Технический результат изобретения поясняется примером и фигурой 1, на которой приведены кинетические кривые люминесценции биосенсора при инкубации его с контрольными токсикантами, а именно, метилметансульфонатом и митомицином С.

Пример 1. Проверка работоспособности биосенсора Е. coli MG1655 pDinA-lux с помощью контрольных токсикантов - Митомицина С, вызывающего остановку репликационной вилки, и метилметансульфоната, вызывающего алкилирование ДНК.

Данные, представленные на фиг.1, представляют из себя кинетические кривые биолюминесценции клеточной культуры при добавлении к ней Митомицина С и метилметансульфоната в различных концентрациях. Кривая «K-» - люминесценция отрицательного контроля, т.е. клеточной культуры с добавлением дистилированной воды вместо токсиканта. «MMS - 3», «MMS - 4», «MMS - 5» - клеточная культура с добавлением метилметансульфоната до конечных концентраций 1 мМ, 100 мкМ и 10 мкМ, соответственно. «MitC - 6», «MitC - 7» и «MitC - 8» - клеточная культура с добавлением митомицина С до конечных концентраций 1 мкМ, 100 нМ и 10 нМ, соответственно.

Фигура показывает, что биосенсор Е. coli MG1655 pDinA-lux индуцируется в ответ на оба токсиканта, следовательно, он чувствителен к различным типам повреждения ДНК. Порог концентрации для митомицина С составляет около 100 нМ. Порог детектируемой концентрации для метилметансульфоната составляет около 100 мкМ. Время начала активации биосенсора составляет около часа. Максимальная амплитуда ответа порядка 10 крат.

Таким образом, заявляемый биосенсор Е. coli MG1655 pDinA-lux способен реагировать на различные виды повреждения ДНК, его амплитуда ответа коррелирует с концентрациями.

Изобретение позволяет определить наличие ДНК-повреждающих агентов в среде.

Использованные источники информации:

[1] Е. Gnuchikh, A. Baranova, V. Schukina, I. Khaliullin, G. Zavilgelsky, and I. Manukhov, "Kinetics of the thermal inactivation and the refolding of bacterial luciferases in Bacillus subtilis and in Escherichia coli differ," PLoS One, vol. 14, no. 12, pp. 1-11, 2019, doi: 10.1371/journal.pone.0226576.

[2] D.G. Deryabin, L.V. Efremova, I.F. Karimov, I.V. Manukhov, E.Y. Gnuchikh, and S.A. Miroshnikov, "Comparative sensitivity of the luminescent Photobacterium phosphoreum, Escherichia coli, and Bacillus subtilis strains to toxic effects of carbon-based nanomaterials and metal nanoparticles," Microbiology (Russian Federation), vol. 85, no. 2, pp. 198-206, 2016, doi: 10.1134/S0026261716020053.

[3] V.S. Danilov and A.D. Ismailov, "Bacterial luciferase as a biosensor of biologically active compounds," Biotechnology, vol. 11, p.39-78, 1989, [Online]. Available: http://europepmc.org/abstract/MED/2650767.

[4] G.B. Zavilgelsky, V.Y. Kotova, and I.V. Manukhov, "Titanium dioxide (Ti02) nanoparticles induce bacterial stress response detectable by specific lux biosensors," Nanotechnol Russ, vol. 6, no. 5, pp. 401-06, 2011, doi: 10.1134/S1995078011030165.

[5] S.K. Abilev, V.Y. Kotova, S.V. Smirnova, T.N. Shapiro, and G.B. Zavilgelsky, "Specific Lux Biosensors of Escherichia coli Containing pRecA::lux, pColD::lux, and pDinI::lux Plasmids fbr Detection of Genotoxic Agents," Russ J Genet, vol. 56, no. 6, pp. 666-673, 2020, doi: 10.1134/S 1022795420060022.

[6] G.B. Zavilgelsky, V.Y. Kotova, and I.V Manukhov, "Action of 1, 1-dimethylhydrazine on bacterial cells is determined by hydrogen peroxide," vol. 634, pp. 172-176, 2007, doi: 10.1016/j.mrgentox.2007.07.012.

[7] V.Y. Kotova, I.V. Manukhov, and G.B. Zavilgelskii, "Lux-biosensors for detection of SOS-response, heat shock, and oxidative stress," Appl Biochem Microbiol, vol. 46, no. 8, pp. 781-788, 2010, doi: 10.1134/S0003683810080089.

[8] Т.K. Van Dyk, W.R. Majarian, К.B. Konstantinov, R.M. Young, P.S. Dhurjati, and R.A. LaRossa, "Rapid and sensitive pollutant detection by induction of heat shock gene-bioluminescence gene fusions," Appl Environ Microbiol, vol. 60, no. 5, pp. 1414-1420, 1994, doi: 10.1128/aem.60.5.1414-1420.1994.

[9] R. A. LaRossa, Bioluminescence Methods and Protocols. 1998. doi: 10.1385/0896035204.

[10] A.C. Vollmer, S. Belkin, D.R. Smulski, Т.K. van Dyk, and R.A. LaRossa, "Detection of DNA damage by use of Escherichia coli carrying recA'::lux, uvrA'::lux, or alkA'::lux reporter plasmids," Appl Environ Microbiol, vol. 63, no. 7, pp.2566-2571, 1997, doi: 10.1128/aem.63.7.2566-2571.1997.

[11] J. Kurittu, S. Lonnberg, M. Virta, and M. Karp, "Qualitative detection of tetracycline residues in milk with a luminescence-based microbial method: The effect of milk composition and assay performance in relation to an immunoassay and a microbial inhibition assay," J Food Prot, vol. 63, no. 7, pp. 953-957, 2000, doi: 10.4315/0362-028X-63.7.953.

[12] E.V. Igonina, M.V. Marsova, and S.K. Abilev, "Lux Biosensors: Screening Biologically Active Compounds for Genotoxicity," Russ J Genet Appl Res, vol. 8, no. 1, pp. 87-95, 2018, doi: 10.1134/S2079059718010082.

[13] S.A. Khrulnova et al., "Lux-operon of the marine psychrophilic bacterium aliivibrio logei: A comparative analysis of the LuxRl/LuxR2 regulatory activity in escherichia coli cells," Microbiology (United Kingdom), vol. 162, no. 4, pp. 717-724, 2016, doi: 10.1099/mic.0.000253.

[14] J.M. Ahn et al., "Prediction and classification of the modes of genotoxic actions using bacterial biosensors specific for DNA damages," Biosens Bioelectron, vol. 25, no. 4, pp. 767-772, Dec. 2009, doi: 10.1016/j.bios.2009.08.025.

[15] Т.K. Van Dyk and R.A. Rosson, "Photorhabdus luminescens LuxCDABE Promoter Probe Vectors," in Methods MolBiol, vol. 102, 1998, p. 8595.

--->

<?xml version="1.0" encoding="ISO-8859-1"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing SYSTEM "ST26SequenceListing_V1_3.dtd" PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN">

<ST26SequenceListing productionDate="2024-09-17" softwareVersion="2.3.0" softwareName="WIPO Sequence" fileName="10(077479).xml" dtdVersion="V1_3" originalFreeTextLanguageCode="ru">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023135426/10(077479)</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-12-26</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>2023135426/10(077479)</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023135426/10(077479)</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-12-26</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский биотехнологический университет (РОСБИОТЕХ)"</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education Russian Biotechnological University</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Бактериальный lux-биосенсор на основе промотора гена бактериальной ДНК-полимеразы II</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>34</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..34</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aggaattggggatcggaatgctggaagaggtcgc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>41</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..41</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agctcggtacccggggatccggttaagataaaacctgcctg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан бактериальный биосенсор Е. coli pDinA-lux, увеличивающий уровень своей люминесценции в ответ на повреждения ДНК, состоящий из клеток Еscherichia coli, трансформированных плазмидой с генами luxCDABE под контролем промотора гена полимеразы II. Техническим результатом изобретения являются клетки Е. coli, позволяющие определять ДНК-повреждающие агенты, вызывающие остановку репликационной вилки или алкилирование азотистых оснований. 1 ил., 1 пр.

Бактериальный биосенсор Е. coli pDinA-lux, увеличивающий уровень своей люминесценции в ответ на повреждения ДНК, состоящий из клеток Еscherichia coli, трансформированных плазмидой с генами luxCDABE под контролем промотора гена полимеразы II.