НАБОР LUX-БИОСЕНСОРОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕПТИЛА В СРЕДЕ Российский патент 2007 года по МПК C12N1/21 C12N15/52 C12N15/70 

Изобретение относится к оценке степени загрязнения окружающей среды гептилом, а также может быть использовано в исследованиях биологических объектов.

Известен способ определения гептила в окружающей среде химическими средствами [1-3]. Существо этого способа заключается в проведении фотометрического анализа продуктов распада гептила или высокоразрешающего хроматографического (газовая хроматография) разделения химических соединений с масс-спектрометрическим детектированием [1], и идентификации гептила и его продуктов распада с помощью методов ЯМР и инфракрасной спектроскопии [2]. Недостатком химических методов является необходимость использования дорогостоящей аппаратуры, а также сложность проведения анализа в связи с высокой нестабильностью гептила [3].

В настоящее время широкое распространение для определения загрязнения окружающей среды токсичными веществами получили методы биотестирования с использованием lux-биосенсоров. Известны методы, основанные на тушении биолюминесценции токсикантами, в которых используется механизм ингибирующего действия ядовитых веществ на метаболизм клетки, в основном, на дыхательную цепь, что опосредованно влияет на люциферазную реакцию, вызывая ослабление интенсивности биолюминесценции клеток. В этой серии методик, используемых в качестве экспресс-контроля токсичности природных сред, наибольшее распространение в странах Европы и в США получил т.н. "Микротокс" ("Microtox 5TM), в котором в качестве биосенсора используются лиофилизированные морские бактерии Photobacterium phosphoreum. Недостатком метода является неспецифичность реакции и невысокая чувствительность. Для идентификации химического соединения, вызвавшего уменьшение интенсивности свечения клеток, требуется дополнительный анализ.

Известно также обнаружение токсикантов с использованием lux-биосенсоров на основе бактерий Escherichia coli, содержащих плазмиды с lux-генами под контролем индуцибельных стрессовых промоторов [4]. Эти lux-биосенсоры, как указано в приведенном патенте США, были использованы для определения нитратов, фенолов, бензина и других токсикантов, но не использовались для обнаружения в среде гептила.

Техническим результатом предложенного изобретения является возможность осуществления быстрого, не требующего дорогой и сложной аппаратуры, как в стационарных, так и в полевых условиях, контроля за содержанием гептила в окружающей среде.

Для достижения этого результата предложено использовать комплекс lux-биосенсоров на основе бактерий Escherichia coli, содержащих гибридные плазмиды с lux-генами под контролем индуцибельных стрессовых промоторов Р_katG, P_soxS, P_recA, P_grpE. В предложенном изобретении для определения гептила использована группа биосенсоров, обладающих свойством индукции (усиления) сигнала (биолюминесценции) клеток при воздействии токсикантом, а также высокой чувствительностью и специфичностью, так как определяется особенностью взаимодействия белка-рецептора (репрессора или активатора) с химическим соединением.

Существо изобретения поясняется прилагаемыми графиками, где на фиг.1 показана зависимость от времени действия гептила (при фиксированной концентрации) на биосенсор P_katG::lux; на фиг.2 - приведена зависимость величины эффекта (при оптимальном времени выдерживания препарата) от концентрации гептила в образце, также для биосенсора P_katG::lux; на фиг.3 показана реакция на гептил (в зависимости от времени действия) на биосенсор P_soxS::lux; на фиг.4 приведена временная зависимость действия гептила на биосенсор P_recA::lux.

В процессе действия гептила на клетку происходит индукция биолюминесценции у биосенсоров P_katG::lux, P_soxS::lux, P_recA::lux, но не P_grpE::lux (поэтому данные для биосенсора P_grpE::lux не приводятся). Как видно из графиков, представленных на фиг.1-4, при выдерживании проб с фиксированной концентрацией гептила наблюдается со временем значительное усиление (примерно в 100 раз) интенсивности биолюминесценции клеток - биосенсоров. На фиг.2 приведена зависимость эффективности действия гептила от его количества в пробе для биосенсора с промотором P_katG. В кривой можно выделить три характерных области. При количестве гептила в пробе более 20 микромолей наблюдается значительный токсический эффект гептила на клетку, что проявляется в гашении биолюминесценции. Этот результат соответствует данным по летальному действию гептила на бактерии Е. coli: гибель бактерий фиксировалась при количестве гептила в пробе выше 20 микромолей [5]. При количествах гептила примерно от 10 до 0,1 микромоля наблюдается значительное усиление биолюминесценции, превышающее исходное значение I₀ более чем в 10 раз. И, наконец, при количестве гептила в пробе менее 0,01 микромоля влияние гептила снижается практически до фона, т.е. пороговая концентрация гептила, фиксируемая lux-биосенсором с промотором P_katG, равна 0,001 мкМ на пробу.

У бактерий можно выделить регуляторные системы, специфически реагирующие на токсиканты, действующие на: 1) клеточные мембраны; 2) белки; 3) хромосому (ДНК), а также 4) индуцирующие в клетке окислительный стресс. В качестве биосенсора на токсиканты, действующие на клеточные белки, предложено использовать промотор P_grpE. Этот промотор в бактериальном геноме расположен перед генами "теплового шока" и открывается лишь при появлении в клетке модифицированных, денатурированных белков. В роли биосенсора на ДНК-тропные агенты используется SOS-промотор Р_recA. Промотор Р_recA открывается лишь при индукции повреждений в геноме, т.е. в молекулах ДНК. Для детекции веществ, индуцирующих в клетке окислительный стресс (образующих в клетке гидроксильный радикал, супероксид-ион-радикал, перекись водорода) были использованы промоторы P_katG и P_soxS. Промотор P_katG (активатор OxyR) специфически реагирует на перекись водорода, органические пероксиды. Промотор P_soxS открывается при появлении в среде супероксид-ион-радикала.

В данном изобретении сконструированы основанные на этих индуцируемых промоторах специфические lux-биосенсоры. Все используемые промоторы с соответствующими регуляторными участками были получены из генома бактерий Escherichia coli K12 MG1655 с помощью метода ПЦР с использованием специальных, синтезированных праймеров. В качестве вектора использовали беспромоторный вектор с репликоном ColE1 и геном bla, определяющим резистентность к ампициллину (селективный маркер). Встраивание промоторной области в плазмиду проводили по сайтам EcoRI-BamHI. В качестве lux-кассеты был выбран lux-оперон Photorhabdus luminescens, состоящий из пяти генов, luxCDABE. Данная кассета имеет два преимущества: во-первых, люцифераза Ph. luminescens (гены luxAB) отличается сравнительно высокой термостабильностью, а, во-вторых, к суспензии клеток не надо добавлять субстрат люциферазной реакции - алифатический альдегид, так как он синтезируется в клетке при помощи белков, кодируемых генами luxCDE [6].

Методика измерения влияния токсиканта на биолюминесценцию биосенсора была примерно одинаковой для всех lux-биосенсоров.

Определение гептила в среде с помощью lux-биосенсоров требует проведения следующих операций.

1. Приготовление проб, содержащих соответствующие биосенсоры;

- выращивание клеток Е. coli, являющихся биосенсорами, до экспоненциальной фазы (OD=0,2-0,4);

- отбор проб по 200 мкл в виалы (6-8 виал для каждого биосенсора).

2. Добавление к пробам гептила или жидкой среды с гептилом в различных концентрациях;

- приготовление для каждого биосенсора положительного и отрицательного контролей. В качестве положительного контроля используют гептил (разведенный в воде) в концентрации 20 мкг/мл (отрицательный контроль - дистиллированная вода);

- добавление по 20 мкл исследуемой среды к каждой пробе каждого биосенсора.

(Все пробы следует приготовить в двойном или тройном экземплярах и затем использовать средние значения полученных экспериментальных величин).

3. Измерение интенсивностей биолюминесценции проб в течение 1-2 часов для биосенсоров P_katG::lux, P_soxS::lux, P_grpE:lux. Для биосенсора P_recA::lux измерение следует проводить 2,5-3 часа.

4. Обработка полученных результатов. Полученные графики на контрольных образцах сравнивают с исследуемым образцом.

Культуру клеток, содержащих гибридную плазмиду с соответствующим промотором и lux-кассетой, растили при 28°С или 37°С на качалке до ранней или средней экспоненциальной фазы (OD=0,2-0,4). Аликвоты этой культуры (по 200 мкл) переносили в стерильные виалы и добавляли в них по 10 мкл тестируемого вещества требуемой концентрации. В контрольную пробирку добавляли 10 мкл дистиллированной воды. Затем пробы инкубировали без перемешивания при 30°С и через каждые 15 мин измеряли интенсивность биолюминесценции при комнатной температуре. Усиление сигнала фиксировалось уже через 15-20 мин - время, необходимое для синтеза люциферазы. Максимальный ответ биосенсора, как правило, наблюдался через 40-60 мин (в случае промотора P_recA максимальный сигнал фиксировался через 90 мин) и при оптимальной концентрации токсиканта превышал начальный сигнал в 100-1000 раз.

В результате наших исследований было показано, что основными промоторами, открывающимися при воздействии на клетки гептила, являются промоторы P_katG, P_soxS, P_recA. Биосенсор С промотором P_grpE не изменял интенсивность биолюминесценции. Поэтому данные по данному промотору не приведены на фиг.1-4.

В табл.1 приведены данные о минимальных (пороговых) концентрациях стандартных, специфических для данного промотора веществ, индуцирующих заметный (в 2-3 раза) эффект усиления биолюминесценции, в конструированных lux-биосенсорах (митомицин С индуцирует повреждения в ДНК, этанол - в белках, перекись водорода и паракват как генератор супероксид-ион-радикалов индуцируют окислительный стресс).

Таблица 1БиосенсорСтандартное веществоПороговая концентрация, М/лФактор индукции биолюминесценцииP_recA::luxМитомицин С10^-83,3P_katG::luxН₂О₂5×10^-72,2P_grpE::luxЭтанол0,5%2,1P_soxS::luxпаракват10^-72,3

Гептил, по всей видимости, в отличие от представленных в табл.1 соединений, не обладает высокой специфичностью к тому или другому биосенсору, так как в связи с высокой реакционной активностью (очень сильный восстановитель) способен повреждать макромолекулы. Поэтому оптимальным решением проблемы фиксации гептила в среде является использование всех вышеуказанных lux-биосенсоров.

Так как промотор P_katG открывается лишь при воздействии перекиси водорода на белок-регулятор OxyR (окисление активного центра [Fe-S]), a промотор P_soxS открывается лишь при воздействии супероксид-ион-радикала, то можно считать доказанным, что действие гептила на бактериальную клетку в основном определяется формированием активных форм кислорода, в частности, гидроперекиси и супероксид-ион-радикала (в результате восстановления кислорода воздуха до перекиси водорода).

Гидроперекись, образованная в результате химических реакций гептила H₂NN(CH₃)₂ в основном с кислородом O₂, открывает промотор P_katG, причем столь же эффективно, как и перекись водорода, используемая в качестве стандарта:

O₂+H₂NN(CH₃)₂=O₂H (супероксид-радикал) +HNN(CH₃)₂, причем супероксид-радикал быстро переходит в перекись водорода:

2O₂Н=Н₂O₂+O₂

Превращение супероксид-ион-радикала в перекись водорода происходит как спонтанно, так и в результате действия клеточного фермента супероксид-дисмутазы.

Действие гептила на ДНК и, соответственно, на промотор Р_recA, носит косвенный характер и определяется в основном формирующимися активными формами кислорода. Этот вывод следует из данных о влиянии перекиси водорода на биосенсор P_recA::lux, а также из данных по практическому совпадению концентрационных зависимостей эффектов гептила и перекиси водорода на биосенсоры P_katG::lux и P_recA::lux до концентраций 10^-7-10^-6 М/л.

Влияние гептила на биосенсор P_grpE::lux практически отсутствует, поэтому данные о воздействии гептила на этот биосенсор не приводятся. Гептил не модифицирует клеточные белки, так как не проникает в цитоплазму клетки, а весь расходуется (окисляется) вне клетки.

Изобретение позволяет создать высокочувствительный, дешевый и быстрый тест-метод на основе измерения интенсивности биолюминесценции.

Источники информации

1. Дмитриев О.Ю., Иваненко С.И., Овсянников Д.А., Смирнова С.С., Чистова Ж.А. В Сб. "Труды Российской инженерной академии, Секция "Инженерные проблемы стабильности и конверсии", Выпуск 11. "Экологические проблемы разработки и эксплуатации ракетно-космической техники", Москва, СИП РИА, 2004 г., стр.40-43.

2. Лопырев В.А., Долгушин Г.В., Ласкин Б.М. (2001) Журнал Рос. хим. об-ва им. Д.И.Менделеева, т.XLV, №5-6, стр.149-156.

3. Кузнецова Л.В. В Сб. "Труды Российской инженерной академии, Секция "Инженерные проблемы стабильности и конверсии", Выпуск 12. "Экологические проблемы разработки и эксплуатации ракетно-космической техники", Москва, СИП РИА, 2004 г., стр.24-25.

4. Патент США №5683868, C12Q1/68 - прототип.

5. Anti Poso, Atte von Wright, Jukka Gynther (1995) Mutation Research. V.332. PP.63-71.

6. Завильгельский Г.Б., Зарубина А.П., Манухов И.В. (2002) Молекулярная биология. т.36, стр.792-804.

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии и может быть использовано при оценке степени загрязнения окружающей среды гептилом. Методом рекомбинантных ДНК получены клетки Escherichia coli, содержащие плазмиды с бактериальными luxCDABE-генами под контролем индуцибельных стрессовых промоторов PkatG, PsoxS, PrecA, PgrpE. На их основе разработан набор проб бактериальных клеток Escherichia coli для определения гептила в окружающей среде. Применение изобретения позволяет быстро в стационарных или полевых условиях определять содержание гептила в окружающей среде. 4 ил., 1 табл.

Набор lux-биосенсоров для определения гептила в среде, состоящий из пробы клеток Escherichia coli, трансформированных плазмидой, содержащей бактериальные luxCDABE-гены под контролем промотора P_katG, пробы клеток Escherichia coli, трансформированных плазмидой, содержащей бактериальные luxCDABE-гены под контролем промотора P_soxS, пробы клеток Escherichia coli, трансформированных плазмидой, содержащей бактериальные luxCDABE-гены под контролем промотора P_гесА, пробы клеток Escherichia coli, трансформированных плазмидой, содержащей бактериальные luxCDABE-гены под контролем промотора P_grpE.