РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBMC-RT(А)-hum ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКА ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПТАЗЫ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2009 года по МПК C12N15/79 C12N15/49 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам получения вакцинных препаратов с помощью методов генетической инженерии и иммунологии, и может быть использовано в медицине и смежных отраслях для повышения экспрессии белков, в частности белка RT как фрагмента белка Pol вируса иммунодефицита человека 1 типа ВИЧ-1 субтипа А или его фрагментов и синтетических аналогов в эукариотических клетках.

Одной из глобальных проблем, стоящих перед биотехнологией, является повышение выхода веществ, продуцируемых клетками прокариот и эукариот. Для решения указанных задач, как правило, клетки подвергают воздействию различных внешних факторов: повышению температуры выше 42°С, уменьшению количества питательных веществ, например фосфатов или азота, до уровня, лежащего ниже того, который требуется для выживания микроорганизмов, токсическое воздействие - например, использование красителей, кислот или эксудатов растений, метаболическое разрушение клеток в результате изменения уровня содержания ионов, воздействующих на способность микроорганизмов к осморегуляции, или в уровня содержания введение витаминов или кофакторов, которые способны вызвать прекращение метаболизма (RU 2179980, 2002).

Однако, т.к. воздействие вышеперечисленных факторов на выход конкретных продуцентов характеризуется высокой видоспецифичностью, то для каждого конкретного случая необходимо проведение большого объема исследований.

Наиболее сложно вопросы стимулирования экспрессии решаются в случае получения вакцин против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), для изготовления которых необходимо научиться добиваться экспрессии вирусных белков в клетках эукариот без введения вируса, что позволило бы выработать в организме необходимый иммунный ответ. Проблема связана с особенностями последовательностей генов вируса иммунодефицита человека, в частности, с использованием в вирусных генах кодонов, не характерных для интенсивно экспрессирующихся генов млекопитающих, в частности человека, а также большая вариабельность вирусной популяции выраженная в генетической дивергенции.

Одним из подходов к решению этой проблемы является использование геномов ретровирусов, аденовирусов, папилломавирусов и паповавирусов в качестве стимуляторов для экспрессии протективных антигенов патогенных вирусов в клетках млекопитающих.

Наиболее детально исследования проводились с использованием вируса осповакцины (ВОВ). В частности, были сконструированы рекомбинантные ВОВ, экспрессирующие отдельно индивидуальные белки ВИЧ-1: gp160, gp120, Tat и обратную транскриптазу (Moss В., and Flexner С. // Ann. Rev. Immunol, 1987, v.5, p.305; Moss В. // Seminars in Virology, 1992, v.3, p.277; Falkner F.G., et al. // Virology, 1988, v.164, p.450; Flexner C., et al. // Virology, 1988, v.166, p.339; Takahashi H., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, v.85, p.3105; Walker B.D., et al. // Science, 1988, v.240, p.64; Willey R.L., et al. // J. Virol, 1988, v.62, p.139). Полученные рекомбинантные BOB были использованы для иммунизации лабораторных животных и выявления белков ВИЧ-1, способных вызывать индукцию нейтрализующих вирус антител. Однако с помощью рекомбинантных ВОВ не удалось индуцировать полноценный протективный иммунный ответ против ВИЧ-инфекции. По-видимому, это обусловлено низкой иммуногенностью индивидуальных вирусных белков (RU 2194075, 2002).

Для решения проблемы получения иммунного ответа на белки ВИЧ был создан белок TBI, который включает в свой состав несколько клеточных эпитопов ВИЧ-1. Однако при его использовании не удается получить весь спектр целевых продуктов. Кроме того, степень экспрессии получаемых белков недостаточно высока (RU 2237089, 2005).

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к заявляемому изобретению является стимулирование экспрессии белка RT введением в клетку высших эукариот экспрессионной плазмидной ДНК pBMC-RT(A)m-l, содержащей модифицированный ген RT вируса иммунодефицита человека типа 1 субтипа А, представленный на фиг.1а (2238977, 2004). Недостатком указанного изобретения являлся недостаточно высокий выход целевого продукта и его отличие по нескольким аминокислотам от последовательности белка RT, превалирующей в популяции ВИЧ-1, циркулирующей на территории России.

Технической задачей, решаемой авторами, являлось создание стимулятора синтеза белка RT, позволяющего повысить его выход и иммуногенность.

Технический результат был получен при использовании в качестве стимулятора экспрессионной плазмидной ДНК, содержащей модифицированный фрагмент гена pol (ген RT) вируса иммунодефицита человека типа 1 субтипа А, названный RT(A)m-1, последовательность которого представлена на фиг.1b.

В основу изобретения были положены представления о том, что в генах вируса имеются так называемые ингибирующие участки (INS), в которых много аденина и тимина и редко встречаются гуанин и цитозин. Содержание в составе мРНК таких участков приводит к преждевременному распаду мРНК в клеточном ядре. Для транспорта вирусных мРНК из ядра в цитоплазму вирус использует свой вирусный белок - Rev. Пока Rev не синтезировался и не проник в ядро, вирусные мРНК будут находиться в ядре и там подвергаться деградации. Появившийся в ядре Rev связывается со специфической последовательностью RRE (Rev Responsible Element) в мРНК вируса, переносит мРНК в цитоплазму, где затем синтезируются вирусные белки, в том числе Pol. В результате проведенных авторами исследований было установлено, что при устранении из гена RT ингибирующих участков удается в 10-15 раз повысить выход белка RT. При этом анализ последовательностей гена RT среди ВИЧ-инфицированных людей выявляет различия в аминокислотной последовательности белка. Некоторые аминокислоты, расположенные в известных иммунологически важных областях встречаются с разной частотой в анализируемой популяции. Введение нуклеотидных замен в последовательность гена RT приводящих к наиболее статистически выраженной последовательности белка RT увеличивает его возможности как иммуногена. Кроме того, внесение известных аминокислотных замен в область, соответствующую активному центру RT, приводит к инактивации фермента и возможности уменьшения вероятности побочных эффектов при использовании.

Согласно настоящему изобретению новый стимулятор был получен по следующей методике.

Был осуществлен анализ кодонов в составе фрагмента гена pol, кодирующего белок RT ВИЧ-1 субтипа А. Все кодоны с высоким содержанием аденина и тимина были заменены на синонимичные кодоны со сниженным содержанием аденина и тимина и соответственно более высоким содержанием гуанина и цитозина, при этом в состав гена предпочтительно включали кодоны, характерные для интенсивно экспрессирующихся генов человека. Кроме того, в последовательность гена включили последовательность Козака, инициирующий и два терминирующих трансляцию кодоны. Кодоны, кодирующие несколько аминокислот в некоторых иммунологически важных участках белка RT, были заменены на кодоны аминокислот, превалирующих в популяции ВИЧ-1 на территории России и стран СНГ. Кроме того, были внесены нуклеотидные замены в кодонах нескольких аминокислот, локализованных в области активного центра фермента RT, для инактивации ферментативной активности. В результате с помощью автоматизированного химического синтеза был получен искусственный ген RT(A)-hum, кодирующий искусственный белок RT(A)-hum, который был вставлен в вектор рВМС с получением экспрессионной плазмиды pBMC-RT(A)-hum.

Сущность изобретения поясняется чертежами, на которых представлены:

на фиг.1а - последовательность нуклеотидов гена RT(A)-hum в сравнении с последовательностью нуклеотидов гена RT(A)m-1 (прототип); 1b - ген RT(A)-hum;

на фиг.2 - последовательность нуклеотидов гена RT(A)-hum в сравнении с последовательностью нуклеотидов природного гена RT(A);

на фиг.3 - последовательность аминокислот белка RT(A)-hum в сравнении с последовательностью аминокислот белка RT(A).

Нуклеотиды и аминокислоты, одинаковые для представленных генов, отмечены в сравниваемой последовательности точкой (.), отсутствующие в последовательностях - тильдой (~), различающиеся - приведены соответствующей буквой. Ген RT(A)-hum длиной 1335 нуклеотидов отличается от прототипа RT(A)m-1 по 257 нуклеотидам и по 358 нуклеотидам отличается от природного гена RT(A). Белок RT(A)-hum длиной 443 аминокислот отличается от природного белка RT(A) по 15 аминокислотам.

Промышленная применимость заявляемого стимулятора синтеза белка и синтетического белка иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение плазмидной ДНК, обеспечивающий экспрессию искусственного белка RT(A)-hum с использованием искусственного гена RT(A)-hum.

Искусственный ген RT(A)-hum, последовательность которого представлена на фиг.1, получали при помощи химического синтеза перекрывающихся фрагментов с последующим отжигом и лигированием. Собранный ген вставляли известным способом в плазмидный вектор рВМС с получением экспрессионной плазмиды pBMC-RT(A)-hum. Полученной плазмидой pBMC-RT(A)-hum трансформировали клетки Escherichia coli для ее последующей наработки.

Пример 2. Изучение синтеза синтетического белка RT(A)-hum в эукариотических клетках.

Культуру клеток человека линии 293 трансформировали ДНК рекомбинантной плазмиды pBMC-RT(A)-hum. В качестве контроля параллельную культуру клеток 293 трансформировали равным количеством ДНК плазмиды pBMC-RT(A)m-1. Трансформированные культуры клеток инкубировали в питательной среде в течение 48 часов при температуре +37°С и содержании СО₂ в воздухе, равном 5%, лизировали и анализировали белки клеточных лизатов с помощью электрофореза в ПААГ с последующим иммуноблоттингом с сывороткой пациента, инфицированного ВИЧ-1 субтипа А. Интенсивность окраски полос, соответствующих белку RT, анализировали с помощью компьютизированной видеосистемы. Установлено, что в культуре клеток, трансформированных плазмидной ДНК pBMC-RT(A)-hum, уровень белка RT(A) не менее чем в 6-8 раз выше, чем синтез белка RT(A) в клетках, трансформированных контрольной плазмидой pBMC-RT(A)m-1.

Пример 3. Использование плазмидной ДНК pBMC-RT(A)-hum для иммунизации.

Лабораторным мышам линии BALB/c вводили внутримышечно трехкратно по 10 микрограмм плазмидной ДНК pBMC-RT(A)-hum, контрольной группе мышей вводили аналогичную дозу pBMC-RT(A)m-1. Через 6 недель в сыворотках крови животных определяли титры антител к белку RT известным способом. Результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1
Титры антител в сыворотках крови мышей, иммунизированных плазмидными ДНК pBMC-RT(A)-hum и pBMC-RT(A)m-1 Титры антител при введении ДНК плазмиды pBMC-RT(A)-hum 1:1024 Титры антител при введении ДНК плазмиды pBMC-RT(A)m-1 1:512

Полученные результаты свидетельствуют, что использование заявляемого стимулятора позволяет в 6-8 раз повысить выход синтетического белка RT по сравнению с прототипом.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано в медико-биологической промышленности. Предложена рекомбинантная плазмида pBMC-RT(A)-hum, предназначенная для экспрессии обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека и отличающаяся тем, что содержит искусственный ген (RT(A)-hum) синтезируемого фермента, который характеризуется последовательностью нуклеотидов, оптимально адаптированной к экспрессии в клетках млекопитающих. Использование рекомбинантной плазмиды по изобретению обеспечивает существенное (в 6-8 раз) повышение выхода целевого белка по сравнению с прототипом. 4 ил., 1 табл.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pBMC-RT(A)-hum для экспрессии белка обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека (RT), представленная вектором рВМС, содержащим фрагмент ДНК, который кодирует названную RT, и отличающаяся тем, что указанный фрагмент является искусственным геном, который имеет последовательность нуклеотидов, представленную на фиг.1b.