РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК РВМС-NEF(A)M-1, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ БЕЛОК NEF ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА ТИПА 1 В ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ Российский патент 2004 года по МПК C12N15/63 C12N15/48 

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, в частности к генетической инженерии и иммунологии, и может быть использовано для экспрессии белка nef вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1) субтипа А в эукариотических клетках.

Известны рекомбинантные плазмидные ДНК: pGEX-2T-nef 27, pYEULCBX-nef 27, pVL1393-nef 27, содержащие фрагмент ДНК вируса иммунодефицита человека 1 типа, размером 624 пар оснований, кодирующий вирусный белок NEF (см. Ahmed A. Azad, Paul Failla, Anna Lucantoni, John Bentley, Chris Mardon, Andrew Wolfe, Kerri Fuller, Dean Hewish, Shomik Sengupta, Sonia Sankovich, Elizabeth Grgacic, Dale McPhee, lan Macreadie. Large-scale production and characterization of recombinant human immunodeficiency virus type 1 NEF. Journal of General Virology (1994), 75, 651-655).

Данное техническое решение позволяет осуществить синтез полипептида, кодируемого геном nef вируса иммунодефицита человека 1 типа, в виде рекомбинантного белка в бактериальных, дрожжевых клетках и в культивируемых клетках насекомых. Однако синтез NEF ВИЧ-1 в клетках млекопитающих не осуществляется.

Как следует из приведенного выше анализа уровня техники, близких аналогов, которые могли бы быть приняты за прототип настоящего изобретения, не выявлено.

В основу настоящего изобретения положено решение задачи создания рекомбинантной плазмидной ДНК, которая обеспечивает экспрессию белка NEF, кодируемого геном nef ВИЧ-1 субтипа А в клетках млекопитающих, и тем самым иммунизацию организма человека.

Согласно изобретению эта задача решается за счет того, что рекомбинантная плазмидная ДНК pBMC-nef(A)m-1, экспрессирующая белок nef вируса иммунодефицита человека типа 1 в эукариотических клетках, содержит ген nef вируса иммунодефицита человека типа 1 субтипа А, представленный на фиг.2, при этом в последовательности нуклеотидов гена nef в кодонах с преобладанием аденина и/или тимина аденин и/или тимин частично заменены на гуанин и/или цитозин, а также за счет введения в данный фрагмент последовательности Козака, инициирующего и двух терминирующих кодонов.

Сущность изобретения поясняется чертежами, на которых представлены:

на фиг.1 - последовательность нуклеотидов природного гена nef российского варианта субтипа А ВИЧ-1;

на фиг.2 - последовательность нуклеотидов в модифицированном согласно настоящему изобретению гене nef российского варианта субтипа А ВИЧ-1. (замены оснований подчеркнуты);

на фиг.3 - структура плазмидной ДНК pBMC-nef(A)m-1.

Обозначения на фиг.3: nef(A)m-l - фрагмент ДНК, содержащий измененные нуклеотиды, bla - ген бета-лактамазы, Ori - репликатор, Р - промотор предранних генов белков цитомегаловируса, К - последовательность Козак, BGH - участок терминации транскрипции и полиаденилирования.

Получение плазмидной ДНК pBMC-nef(A)m-1 осуществляется следующим образом.

Фрагмент ДНК, кодирующий ген nef ВИЧ-1 субтипа А, выделяли при помощи полимеразной цепной реакции, матрицей в которой служила ДНК из лимфоцитов периферической крови пациента, инфицированного вирусом иммунодефицита человека первого типа субтипа А. Данный фрагмент клонировали в вектор рВМС, получив плазмиду pBMC-nef(A), содержащую природный ген nef. Далее выделяли полученную плазмиду pBMC-nef(A) и вводили в ее последовательность известным способом фрагменты, содержащие последовательность Козака, инициирующий и терминирующие кодоны с получением плазмиды рВМС-nef(A)-1. Далее выделяли плазмиду pBMC-nef(A)-1 и производили в гене nef необходимые замены нуклеотидов известным способом, получив в результате плазмиду pBMC-nef(A)m-1.

Изучение синтеза белка NEF в эукариотических клетках происходит следующим путем.

Культуру клеток ЗТЗ мыши трансформировали ДНК плазмид рВМС, pBMC-nef(A)-1 и pBMC-nef(A)m-1 (по 1 микрограмму каждой плазмидной ДНК), после чего клетки инкубировали в течение 48 часов при температуре +37°С и содержании СО₂ в воздухе, равном 5%, лизировали и анализировали белки клеточных лизатов с помощью электрофореза в ПААГ с последующим иммуноблоттингом с сывороткой пациента, инфицированного ВИЧ-1 субтипа А. Интенсивность окраски зон, соответствующих белку NEF, анализировали с помощью компьютизированной видеосистемы. Установлено, что в культуре клеток, трансформированных плазмидой pBMC-nef(A)m-1, синтез белка nef в 10-15 раз выше, чем в клетках, трансформированных плазмидой рВМС-nef(A)-1.

Использование плазмидной ДНК pBMC-nef(A)m-1 для иммунизации организма иллюстрируется следующим примером. Лабораторным мышам линии BALB/c вводили внутримышечно по 10 и 25 микрограмм плазмидных ДНК pBMC-nef(A)-1 и pBMC-nef(A)m-1 согласно настоящему изобретению. Иммунизацию повторяли через четыре недели и еще через две недели собирали сыворотки крови иммунизированных животных и определяли в них титр антител к рекомбинантному белку NEF субтипа А известным способом. Результаты приведены в таблице.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, в частности к генетической инженерии и иммунологии. Предложена рекомбинантная плазмидная ДНК рВМС-nef(A)m-1, которая содержит ген nef вируса иммунодефицита человека типа 1 субтипа А, в последовательности нуклеотидов которого в кодонах с преобладанием аденина и/или тимина аденин и/или тимин частично заменены на гуанин и/или цитозин. Плазмида обеспечивает экспрессию белка NEF и может быть использована для иммунизации против вируса иммунодефицита человека. 1 табл., 3 ил.

Рекомбинантная плазмидная ДНК рВМС-nef(A)m-1, экспрессирующая белок nef вируса иммунодефицита человека типа 1 в эукариотических клетках, характеризующаяся тем, что она содержит ген nef вируса иммунодефицита человека типа 1 субтипа А, представленный на фиг.2, при этом в последовательности нуклеотидов гена nef в кодонах с преобладанием аденина и/или тимина аденин и/или тимин частично заменены на гуанин и/или цитозин.