ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBMC-nef(A)-hum Российский патент 2008 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к технологии получения вакцинных препаратов с помощью методов генетической инженерии и иммунологии, и может быть использовано в медицине и смежных отраслях для повышения экспрессии белков, в частности белка Nef вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1) субтипа А или его фрагментов и синтетических аналогов в эукариотических клетках.

Одной из глобальных проблем, стоящих перед биотехнологией, является повышение выхода веществ, продуцируемых клетками прокариот и эукариот. Для решения указанных задач, как правило, клетки подвергают воздействию различных внешних факторов: повышению температуры выше 42°С, уменьшению количества питательных веществ, например фосфатов или азота, до уровня, лежащего ниже того, который требуется для выживания микроорганизмов, токсическое воздействие - например, использование красителей, кислот или эксудатов растений, метаболическое разрушение клеток в результате изменения уровня содержания ионов, воздействующих на способность микроорганизмов к осморегуляции, или уровня содержания витаминов или кофакторов, которые способны вызвать прекращение метаболизма (RU 2179980, 2002).

Однако, т.к. воздействие вышеперечисленных факторов на выход конкретных продуцентов характеризуется высокой видоспецифичностью, то для каждого конкретного случая необходимо проведение большого объема исследований

Наиболее сложно вопросы стимулирования экспрессии решаются в случае получения вакцин против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), для изготовления которых необходимо научиться добиваться экспрессии вирусных белков в клетках эукариот без введения вируса, что позволило бы выработать в организме необходимый иммунный ответ. Проблема связана с особенностями последовательностей генов вируса иммунодефицита человека, в частности с использованием в вирусных генах кодонов, не характерных для интенсивно экспрессирующихся генов млекопитающих, в частности человека, а также большая вариабельность вирусной популяции, выраженная в генетической дивергенции.

Одним из подходов к решению этой проблемы является использование геномов ретро-вирусов, аденовирусов, папилломавирусов и паповавирусов в качестве стимуляторов для экспрессии протективных антигенов патогенных вирусов в клетках млекопитающих.

Наиболее детально исследования проводились с использованием вируса осповакцины (ВОВ). В частности, были сконструированы рекомбинантные ВОВ, экспрессирующие отдельно индивидуальные белки ВИЧ-1: gp160, gp120. Tat и обратную транскриптазу (Moss В., and Flexner С.// Ann. Rev. Immunol, 1987, v.5, p.305; Moss В. // Seminars in Virology, 1992, v.3, p.277; Falkner F.G., et al. // Virology, 1988, v.164, p.450; Flexner C., et al. // Virology, 1988, v.166, p.339; Takahashi H, et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, v.85, p.3105; Walker B.D., et al. // Science, 1988, v.240, p.64; Willey R.L., et al. // J.Virol, 1988, v.62, p.139). Полученные рекомбинантные BOB были использованы для иммунизации лабораторных животных и выявления белков ВИЧ-1, способных вызывать индукцию нейтрализующих вирус антител. Однако с помощью рекомбинантных ВОВ не удалось индуцировать полноценный протективный иммунный ответ против ВИЧ-инфекции. По-видимому, это обусловлено низкой иммуногенностью индивидуальных вирусных белков (RU 2194075, 2002).

Для решения проблемы получения иммунного ответа на белки ВИЧ был создан белок TBI, который включает в свой состав несколько клеточных эпитопов ВИЧ-1. Однако при его использовании не удается получить весь спектр целевых продуктов. Кроме того, степень экспрессии получаемых белков недостаточно высока (RU 2237089, 2005).

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к заявляемому изобретению является стимулирование экспрессии белка Nef, введением в клетку высших эукариот экспрессионной плазмидной ДНК pBMC-nef(A)m-1, содержащей модифицированный ген nef вируса иммунодефицита человека типа 1 субтипа А (RU 2229518, 2002).

Технической задачей, решаемой авторами, являлось создание экспрессионной плазмидной ДНК для экспрессии синтетического белка Nef(A)-hum, позволяющей повысить его выход и иммуногенность.

Технический результат был получен при использовании экспрессионной плазмидной ДНК pBMC-nef(A)-hum, содержащей модифицированный ген nef вируса иммунодефицита человека типа 1 субтипа А, названный nef(A)m-1, последовательность которого представлена на фиг.1.

В основу изобретения были положены представления о том, что в генах вируса имеются кодоны, в которых преобладает много аденина и тимина и редко встречаются гуанин и цитозин, не характерные для интенсивно экспрессирующихся генов человека. В результате проведенных авторами исследований было установлено, что при замене в гене nef части А и Т - богатых кодонов на синонимические G и С - богатые кодоны удается в 10-15 раз повысить выход белка Nef(A)-hum.

Недостатками указанного изобретения являются: относительно невысокий выход целевого продукта и низкая встречаемость некоторых аминокислот синтезируемого белка Nef(A)-hum в популяции ВИЧ-1, циркулирующей на территории России.

Согласно настоящему изобретению новая плазмидная ДНК pBMC-nef(A)-hum была получена по следующей методике.

Был осуществлен анализ кодонов в составе фрагмента гена nef, кодирующего белок Nef ВИЧ-1 субтипа А. Все кодоны с высоким содержанием аденина и тимина были заменены на синонимичные кодоны со сниженным содержанием аденина и тимина и соответственно более высоким содержанием гуанина и цитозина, при этом в состав гена предпочтительно включали кодоны, характерные для интенсивно экспрессирующихся генов человека. Кроме того, в последовательность гена включили последовательность Козака, инициирующий и два терминирующих трансляцию кодоны. Также были выявлены кодоны, кодирующие некоторые редко встречаемые аминокислоты в иммунологически важных областях белка Nef и заменены на кодоны аминокислот, встречающихся чаще в популяции инфицированных ВИЧ людей на территории России и стран СНГ. Кроме того, из последовательности были удалены кодоны, кодирующие первых две NH₂-концевые аминокислоты белка Nef, что делает невозможным его миристелирование, нежелательное при использовании данного белка в качестве иммуногена. В результате с помощью автоматизированного химического синтеза был получен искусственный ген nef(A)-hum, кодирующий синтетический белок Nef(A)-hum, который был вставлен в вектор рВМС с получением экспрессионной плазмиды pBMC-nef(A)-hum.

Сущность изобретения поясняется чертежами, на которых представлены:

на фиг.1 - последовательность нуклеотидов гена nef(A)-hum в сравнении с последовательностью нуклеотидов генапе1(А)m-1 (прототип);

на фиг.2 - последовательность нуклеотидов гена nef(A)-hum в сравнении с последовательностью нуклеотидов природного гена nef(A);

на фиг.3 - последовательность аминокислот белка Nef(A)-hum в сравнении с последовательностью аминокислот белка Nef(A) (прототип).

Нуклеотиды и аминокислоты, одинаковые для представленных генов, отмечены в сравниваемой последовательности точкой (.), отсутствующие в последовательностях - тильдой (˜), различающиеся - приведены соответствующей буквой, терминирующие кодоны обозначены (*). Ген nef(A)-hum длиной 627 нуклеотидов отличается от прототипа Nef(A)m-1 по 104 нуклеотидам и по 175 нуклеотидам отличается от природного гена nef(A). Белок Nef(A)-syn длиной 207 аминокислот отличается от прототипа Nef(A) по 9 аминокислотам.

Промышленная применимость заявляемого стимулятора синтеза белка и синтетического белка иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение плазмидной ДНК, обеспечивающий экспрессию синтетического белка Nef(A)-hum с использованием искусственного гена nef(A)-hum.

Искусственный ген nef(A)-hum, последовательность которого представлена на фиг.1, получали при помощи химического синтеза перекрывающихся фрагментов с последующим отжигом и лигированием. Собранный ген вставляли известным способом в плазмидный вектор рВМС с получением экспрессионной плазмиды pBMC-nef(A)-hum. Полученной плазмидой pBMC-nef(A)-hum трансформировали клетки Escherichia coli для ее последующей наработки.

Пример 2. Изучение синтеза синтетического белка Nef(A)-hum в эукариотических клетках.

Культуру клеток человека линии 293 трансформировали ДНК рекомбинантной плазмиды pBMC-nef(A)-hum. В качестве контроля параллельную культуру клеток 293 трансформировали равным количеством ДНК плазмиды pBMC-nef(A)m-1. Трансформированные культуры клеток инкубировали в питательной среде в течение 48 часов при температуре +37°С и содержании СО₂ в воздухе, равном 5%, лизировали и анализировали белки клеточных лизатов с помощью электрофореза в ПААГ с последующим иммуноблоттингом с сывороткой пациента, инфицированного ВИЧ-1 субтипа А. Интенсивность окраски полос, соответствующих белку Nef, анализировали с помощью компьютизированной видеосистемы. Установлено, что в культуре клеток, трансформированных плазмидной ДНК pBMC-nef(A)-hum, уровень синтеза белка Nef(A)-hum не менее чем 6-8 раз выше, чем синтез белка Nef(A) в клетках, трансформированных контрольной плазмидой pBMC-nef(A)m-1.

Пример 3. Использование плазмидной ДНК pBMC-nef(A)-hum для иммунизации.

Лабораторным мышам линии BALB/c вводили внутримышечно трехкратно по 10 микрограмм плазмидной ДНК pBMC-nef(A)-hum, контрольной группе мышей вводили аналогичную дозу pBMC-nef(A)m-1. Через 6 недель в сыворотках крови животных определяли титры антител к природному белку Nef известным способом. Результаты приведены в таблице.

Таблица Титры антител в сыворотках крови мышей, иммунизированных плазмидными ДНК pBMC-RT(A)-hum и pBMC-RT(A)m-1Титры антител при введении ДНК плазмиды pBMC-nef(A)-hum1:2048Титры антител при введении ДНК плазмиды pBMC-nef(A)m-11:512

Использование заявляемого стимулятора позволяет в 4-5 раз повысить выход синтетического белка Nef по сравнению с прототипом.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам получения вакцинных препаратов с помощью методов генетической инженерии и иммунологии. Предложена плазмидная ДНК рВМС-nef(A)-hum для экспрессии белка Nef вируса иммунодефицита человека субтипа А, содержащая искусственный ген nef(A)-hum, кодирующий полипептид Nef(A)-hum. Изобретение может быть использовано в медицине и смежных отраслях для повышения экспрессии кодируемого геном nef белка Nef или его фрагментов в эукариотических клетках. 3 ил., 1 табл.

Экспрессионная плазмидная ДНК pBMC-nef(A)-hum для экспрессии синтетического белка Nef(A)-hum в клетках эукариот, содержащая экспрессионную плазмидную ДНК, отличающаяся тем, что она содержит искусственный ген nef(A)-hum, имеющий последовательность нуклеотидов, представленную на фиг.1, и кодирующий полипептид, последовательность аминокислот которого представлена на фиг.3.