РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PBMC-GAG(A)MOD ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКА GAG ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА В ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ Российский патент 2004 года по МПК C12N15/48 C12N15/63 

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, в частности, к генетической инженерии и иммунологии, и может быть использовано для иммунизации против вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1) субтипа А в эукариотических клетках.

Известна рекомбинантная плазмидная ДНК pATLG 579, обеспечивающая синтез в клетках Escherichia coli гибридного белка, кодируемого фрагментом гена gag Т-лимфотропного вируса человека (HTLV) и обладающего антигенными свойствами по отношению к антителам против указанного вируса I и II типа. Гибридный белок, кодируемый данной плазмидой, состоит из 579 аминоктслот, из которых 234 аминокислоты представляют собой полипептид, кодируемый геном gag HTLV, участок длиной в 341 аминокислоту является фрагментом бета-галактозидазы и еще 4 аминокислоты кодируются полилинкером вектора. Кроме того, в состав данной плазмиды входит фрагмент вектора pUR290 размером 5,2 т.п.н., содержащий служебные последовательности: промотор, обеспечивающий экспрессию гибридного белка в клетках Escherichia coli, бактериальный репликатор и ген устойчивости к ампициллину, используемый в качестве селективного маркера. Для получения данной плазмиды на матрице промежуточной плазмиды pSma 2131 с помощью полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами, содержащими на своих концах сайты рестрикции ВамН I и Сlа I, амплифицируют фрагмент гена gag, который очищают при помощи электрофореза в агарозе, гидролизуют рестриктазами ВамН I и Сlа I и лигируют с обработанным данными рестриктазами вектором pUR 290. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки Escherichia coli с последующим отбором трансформированных клонов по способности расти на питательной среде с ампициллином. Далее осуществляют культивирование трансформированных клеток Escherichia coli в жидкой питательной среде с последующей очисткой из полученной биомассы гибридного белка, обладающего антигенными свойствами HTLV I/II, см. RU 2149876.

Данное техническое решение позволяет осуществлять синтез полипептида, кодируемого геном gag, в виде гибридного белка в бактериальных клетках. Однако синтез белков, кодируемых геном gag, в клетках высших эукариот не осуществляется.

Известна рекомбинантная плазмидная ДНК pGDN, обеспечивающая синтез в ктетках Escherichia coli гибридного белка, содержащего полипептид, кодируемый фрагментом гена gag вируса HTLV I типа. Данная рекомбинантная плазмидная ДНК содержит NcoI - Sma I фрагмент гена gag вируса HTLV-1, фрагмент гена бета-галактозидазы, служебные последовательности: промотор, обеспечивающий экспрессию гибридного белка в клетках Escherichia coli, бактериальный репликатор, ген устойчивости к ампициллину, используемый в качестве селективного маркера, и уникальные сайты рестрикции BamHI, PstI, Stu I, Tth111-II. Для получения данной плазмиды Nco I - Sma I фрагмент гена gag генома HTLV-I, кодирующего белки матрикса и нуклеокапсида, выделенный из плазмиды рМТ2, содержащей полноразмерную копию генома вируса, встраивают в плазмидный вектор pUR290. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки Escherichia coli с последующим отбором трансформированных клонов по способности расти на питательной среде с ампициллином. Далее трансформированные клетки Escherichia coli культивируют известным способом с последующей очисткой гибридного белка, обладающего антигенными свойствами вируса HTLV I типа, см. RU, A1, 93058018.

Данное техническое решение позволяет осуществлять синтез полипептида, кодируемого геном gag, в виде гибридного белка в бактериальных клетках. Однако синтез белков, кодируемых геном gag, в клетках высших эукариот также не осуществляется.

Как следует из приведенного выше анализа уровня техники, близких аналогов, которые могли бы быть приняты за прототип настоящего изобретения, не выявлено.

В основу настоящего изобретения положено решение задачи создания рекомбинантной плазмидной ДНК, которая обеспечивает экпрессию белков р17, р24, р6 и р7, в виде общего белка-предшественника, кодируемого геном gag вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) типа 1 субтипа А в клетках высших эукариот.

Согласно изобретению эта задача решается за счет того, что рекомбинантная плазмидная ДНК pBMC-gag(A)mod для экспрессии белка gag вируса иммунодефицита человека в эукариотических клетках содержит ген gag вируса иммунодефицита человека типа 1 субтипа А, представленный на фиг.2.

Сущность изобретения поясняется чертежами, на которых представлены:

на фиг.1 - последовательность нуклеотидов гена gag российского варианта субтипа А ВИЧ-1;

на фиг.2 - последовательность нуклеотидов в модифицированном гене gag российского варианта субтипа А ВИЧ-1. Замены оснований подчеркнуты;

на фиг.3 - структура плазмидной ДНК pBMC-gag(A)mod-1.

Обозначения на фиг.3: bla - ген бета-лактамазы, ori - репликатор, Р - промотор предранних белков цитомегаловируса, BGH - участок терминации транскрипции и полиаденилирования, gag(A)mod - фрагмент ДНК, содержащий измененные нуклеотиды.

Получение плазмидной ДНК pBMC-gag(A)mod осуществляется следующим образом. Фрагмент ДНК, кодирующий ген gag ВИЧ-1 субтипа А, выделяли при помощи полимеразной цепной реакции, матрицей в которой служила ДНК из лимфоцитов периферической крови пациента, инфицированного вирусом иммунодефицита человека первого типа субтипа А. Данный фрагмент клонировали в плазмидный вектор рВМС, получив в результате плазмиду pBMCgag(A), содержащую природный ген gag. Далее выделяли полученную плазмиду pBMCgag(A) и вводили в последовательность гена gp120 необходимые замены нуклеотидов известным способом, получив в результате плазмиду pBMCgag(A)-mod. Полученной плазмидой pBMCgag(A)-mod трансформировали клетки Escherichia coli для последующей наработки.

Изучение синтеза белка-предшественника р55 в эукариотических клетках происходит следующим путем. Культуру клеток 3Т3 мыши трансформировали ДНК рекомбинантной плазмиды pBMCgag(A)-mod. В качестве контроля параллельную культуру клеток 3Т3 трансформировали равным количеством ДНК плазмиды pBMCgag(A), в которой замену нуклеотидов не производили. Трансформированные культуры клеток инкубировали в течение 48-72 часов при температуре +37°С и содержании СO₂ в воздухе, равном 5%, лизировали и анализировали белки клеточных лизатов с помощью электрофореза в ПААГ с последующим иммуноблоттингом с сывороткой пациента, инфицированного ВИЧ-1 субтипа А. Интенсивность окраски полос, соответствующих белку-предшественнику белков gag, p55, анализировали с помощью компьютизи-рованной видеосистемы. Установлено, что в культуре клеток, трансформированных плазмидной ДНК pBMCgag(A)-mod, синтез белка p55 в 6-10 раз выше, чем в клетках, трансформированных контрольной плазмидой pBMCgag(A).

Использование плазмидной ДНК pBMCgag(A)-mod для иммунизации организма иллюстрируется следующим примером. Лабораторным мышам линии BALB/c вводили внутримышечно по 10 и 25 микрограмм плазмидной ДНК pBMCgag(A)-mod согласно настоящему изобретению; контрольной группе мышей вводили аналогичные дозы pBMCgag(A) (известная плазмидная ДНК). Через 6 недель в сыворотках крови животных определяли титры антител к белку gag известным способом. Результаты приведены в таблице.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, в частности к генетической инженерии и иммунологии. Предложена рекомбинантная плазмидная ДНК pBMC-gag(A)mod. Плазмида содержит в своем составе ген gag вируса иммунодефицита человека типа 1 субтипа А, в последовательности нуклеотидов которого в кодонах с преобладанием аденина и/или тимина аденин и/или тимин частично заменены на гуанин и/или цитозин. Плазмида обеспечивает высокий уровень экспрессии белка gag вируса иммунодефицита человека в эукариотических клетках. Предложенная плазмида может быть использована для иммунизации против вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1) субтипа А. 3 ил., 1 табл.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pBMC-gag(A)mod для экспрессии белка gag вируса иммунодефицита человека в эукариотических клетках, характеризующаяся тем, что она содержит ген gag вируса иммунодефицита человека типа 1 субтипа А, представленный на фиг.2.