РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК РВМС-QP120(A)M-1 ДЛЯ ИММУНИЗАЦИИ ПРОТИВ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2004 года по МПК C12N15/63 C12N15/48 

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, в частности, к генетической инженерии и иммунологии, и может быть использовано для экспрессии белка gp120 вируса иммунодефицита человека 1 типа в эукариотических клетках.

Известна рекомбинантная плазмидная ДНК, обеспечивающая высокий уровень продукции гибридного белка, обладающего антигенными свойствами поверхностного гликопротеида (gp) оболочки вируса Т-клеточного лейкоза человека 1 типа (HTLV-I), способная наследоваться в штаммах бактерий Е. coli. Рекомбинантная плазмидная ДНК pESG размером 5, 6 т.п.н. состоит из SalGl – BamH1 фрагмента (426 п.н.) последовательности области env HTLV-I и SalGl фрагмента плазмиды pUR291 размером 5,2 т.п.н. с геном бета-галактозидазы, областью ori и генетическим маркером в виде blа-гена (устойчивость к ампициллину), имеет уникальные сайты рестрикции ВаmHI, Pstl, HindIII, Stul, Clal, Tthlll-II; с помощью фермента рестрикции SalGl из промежуточной плазмиды pBEl вырезан фрагмент величиной 426 п.н. Этот фрагмент лигируют с линеанизированной гидролизом SalGl формой ДНК плазмидного вектора pUR291. После соответствующей инкубации трансформируют полученным препаратом компетентные (обработанные СаС1з) клетки Е.соli с последующим отбором трансформантом их способности расти на среде, содержащей ампициллин, RU 2081172 Al.

Данное техническое решение позволяет осуществить продукцию белка оболочки вируса HTLV-1 в бактериальных клетках. Однако экспрессия белка оболочки вируса иммунодефицита человека в клетках высших эукариот не осуществляется.

Известна рекомбинантная плазмидная ДНК pUE 41, кодирующая фрагменты белков оболочки gp120 и gp41 вируса иммунодефицита человека типа 1 размером 5700 н.п. и мол. м. 3, 7, содержащая Bam HI - Hind III - фрагмент плазмидной ДНК pUR292 размером 5180 н.п.; уникальный сайт рестрикции Hind III; гены и генетические маркеры; ген bla - обеспечивающий синтез β-лактамазы; ген lacz, обеспечивающий синтез β-галактозидазы; фрагмент гена env ВИЧ-1, обеспечивающий синтез полипептида, обладающего антигенным свойством белков оболочки вируса иммунодефицита человека типа 1, RU 1766070.

Данная ДНК позволяет осуществить продуцирование фрагментов белков оболочки вируса иммунодефицита человека типа 1 в клетках бактерий, но не в клетках высших эукариот, что не позволяет осуществить ДНК-иммунизацию организма человека.

Как следует из приведенного выше анализа уровня техники, близких аналогов, которые могли бы быть приняты за прототип настоящего изобретения, не выявлено.

В основу настоящего изобретения положено решение задачи создания рекомбинантной плазмидной ДНК, которая обеспечивает экспрессию белка gp120, кодируемого геном env вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) субтипа А российского изолята в эукариотических клетках млекопитающих.

Согласно изобретению эта задача решается за счет того, что в рекомбинантной плазмидной ДНК pBMC-gpl20(A)m-l для экспрессии белка вируса иммунодефицита человека gpl20 в эукариотических клетках новым является то, что она содержит ген gp 120 вируса иммунодефицита человека типа 1 субтипа А, представленный на фиг.2.

На фиг. 1 приведена природная нуклеотидная последовательность гена gpl20 ВИЧ-1 субтипа А российского изолята 98UA0116 и природная аминокислотная последовательность кодируемого данным геном белка gpl20;

на фиг.2 приведено сравнение нуклеотидных последовательностей исходного (120А) и модифицированного в соответствии с настоящим изобретением гена gp120 ВИЧ-1 российского варианта субтипа А (120А MOD), замены нуклеотидов подчеркнуты;

на фиг.3 приведена структура плазмидной ДНК pBMC-gp120(A)m-l.

Обозначения на фиг.3: gp120(A)m-l - фрагмент ДНК, содержащий ген gp120(A), измененный соответственно настоящему изобретению; bla - ген бета-лактамазы; Ori - репликатор плазмиды pBR322; Р - промотор предранних белков цитомегаловируса (pCMV_IE); pA BGH - участок терминации транскрипции и полиаденилирования.

Фрагмент ДНК, кодирующий ген gpl20 ВИЧ-1 субтипа А, выделяли при помощи полимеразной цепной реакции, матрицей в которой служила ДНК из лимфоцитов периферической крови пациента, инфицированного вирусом иммунодефицита человека первого типа субтипа А. Полученный фрагмент клонировали в плазмидный вектор рВМС, получив в результате плазмиду pBMCgp120(A), содержащую природный ген gpl20. Далее выделяли плазмиду pBMC-gpl20(A)-l и производили в гене gpl20 необходимые замены нуклеотидов известным способом с получением плазмиды pBMC-gp 120(A)m-1.

В качестве теста культуру клеток 3Т3 мыши трансформировали ДНК плазмид pBMC-gp 120(А)-1 и рВМС-gpl20(A)m-l (по 1 микрограмму каждой плазмидной ДНК), после чего клетки инкубировали в течение 48-72 часов, лизировали и анализировали белки клеточных лизатов с помощью электрофореза в ПААГ с последующим иммуноблоттингом с сывороткой пациента, инфицированного ВИЧ-1 субтипа А. Интенсивность окраски полос, соответствующих белку gp120, анализировали с помощью компьютизированной видеосистемы. Установлено, что в культуре клеток, трансформированных плазмидной ДНК, синтез белка gpl20 в 5-10 раз выше, чем в клетках, трансформированных плазмидой, содержащей природный ген. Установлено, что в культуре клеток, трансформированных плазмидой pBMC-gp120(A)m-l, синтез белка gpl20 в 10-15 раз выше, чем в клетках, трансформированных плазмидой pBMC-gp 120(A)-1.

Лабораторным мышам линии BALB/c вводили внутримышечно по 10 и 25 микрограмм плазмидных ДНК pBMC-gp 120(А)-1 и pBMC-gp 120(A)m-l согласно настоящему изобретению. Иммунизацию повторяли через четыре недели. Через две недели после второго введения плазмид собирали сыворотки крови иммунизированных животных и определяли в них титр антител к рекомбинантному белку gpl20 субтипа А известным способом.Результаты приведены в таблице.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, в частности, к генетической инженерии и иммунологии и может быть использовано для иммунизации против вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1) субтипа А. В рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей ген gp 120 вируса иммунодефицита человека типа 1 субтипа А в последовательности нуклеотидов в кодонах с преобладанием аденина и/или тимина аденин и/или тимин частично заменены на гуанин и/или цитозин. Полученная рекомбинантная плазмидная ДНК обеспечивает экспрессию белка оболочки вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) типа 1 субтипа А в клетках высших эукариот. Изобретение позволяет проводить непосредственно иммунизацию организма человека. 1 табл., 3 ил.

Рекомбинантная плазмидная ДНК рВМС-gр120(А)m-1 для экспрессии белка вируса иммунодефицита человека gp120 в эукариотических клетках, характеризующаяся тем, что она содержит ген gp 120 вируса иммунодефицита человека типа 1 субтипа А, представленный на фиг.2.