АНТИГЕН ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТИВОРАКОВЫХ АНТИТЕЛ Российский патент 2009 года по МПК A61K39/02 G01N33/53 C12N1/20 

Изобретение относится к медицине и касается серологического определения противораковых антител.

При диагностике инфекционных заболеваний, например холеры («Микробиология и лабораторная диагностика холеры» под ред. М.С.Дрожевкиной и В.Н.Милютина. Из-во Ростов, ГПЧИ, 1975), бруцеллеза (П.А.Вершилова. Бруцеллез. М.: Медицина, 1972; К.П.Студенцов. Бруцеллез животных. Кайнар, Алма-Ата, 1975), в серологической практике широкое распространение получили специфические антигены, изготовленные из микробных клеток и их компонентов. Строго специфических раковых антигенов для определения раковых антител не разработано. Поэтому серологических методов диагностики для массового профилактического обследования в онкологии не существует.

Задача изобретения - разработка антигена, с помощью которого можно было бы определять в сыворотке крови противораковые антитела.

Поставленная цель достигается тем, что при приготовлении диагностического ракового антигена используют бактерии в стабильной, нереверсивной Л-форме. Это обосновывается тем, что цитоплазматические мембраны Л-форм бактерий родственны по антигенной структуре с цитоплазматическими мембранами раковых клеток, и при перекрестной адсорбции иммунных сывороток против Л-формы бактерий и против раковых клеток антигенами из Л-форм и раковых клеток происходит истощение антител в этих сыворотках. На этом же антигенном родстве основана и предложенная нами ранее вакцина против рака из Л-формы бактерий (Заявка на изобретение №2003124662, опубл. 27.02.2005).

Предлагаемый штамм в Л-форме №118 Л2, утратил клеточную стенку, все видовые признаки и не может быть отнесен ни к одному виду согласно «определителю бактерий «Берджи», штамм выделен в 1982 г. путем посева вытяжки из почвы, подвергнутой биотермическому обеззараживанию на селективные среды, содержащей 100000 ЕД пенициллина и 80 мг хлористого аммония в 1 мл среды, с 1982 г. находится в коллекции автора и хранится на питательных средах без изменения его свойств.

Культурально-морфологические признаки - клетки кокковой формы размером 0,5-2,5 мкм неподвижные, грамотрицательные. В изотоническом растворе и при понижении атмосферного давления лизируются, растут на всех питательных средах для гетеротрофных микроорганизмов при температуре от 15 до 45°С. В бульоне сохраняют жизнеспособность более года при температуре (+2)-(+8)°С. На агаре образуют гигантские ползучие колонии, и энергия роста превосходит рост других Л-форм бактерий, полученных из молочно-кислых бактерий, вакцинных бруцеллезных №19, №16/4 и вакцинного туляремийного штамма.

Физиологические признаки - обладают одинаково высокой гликолитической активностью в аэробных и анаэробных условиях, не усваивают кислород, обладают высокой каталазной активностью, разжижают желатину, обладают уреазной активностью, продуцируют сероводород.

Вирулентные свойства - инфективными и инвазивными свойствами не обладают. При подкожном введении кроликам и морским свинкам проявляют токсигенные свойства в виде местного некроза участка кожи при введении более 10 млрд. микробных клеток. При введении менее 10 млрд. микробных клеток образуется воспалительный отек участка кожи без заселения и образования патологических процессов во внутренних органах и на коже.

Антигенные свойства - при подкожном введении менее 10 млрд. микробных клеток лабораторным животным штамма №118-Л2 в их крови вырабатываются специфические антитела, которые полностью адсорбируются из сывороток при добавлении к ним ракового антигена, полученного путем осаждения центрифугированием плевральной и асцитной жидкостей, взятых у больных раком в 4 стадии. И наоборот, антитела, полученные при иммунизации животных раковым антигеном, полностью адсорбируются антигеном из штамма №118-Л2 форме. Это свойство дает возможность определять титр противораковых антител в разведенных сыворотках крови с помощью антигенов, приготовленных из раковых клеток или лучше из Л-форм бактерий, т.к. их размножение возможно в неограниченных количествах на питательных средах, а такое же размножение раковых клеток невозможно.

Приготовление антигена для постановки реакции агглютинации.

Выросшую на питательных средах бак. массу осаждают и убивают этиловым спиртом, смешивая по объему 1:2. Тщательно встряхивают и оставляют на 1 сутки, в течение которых еще 3-4 раза перемешивают. Затем бак. массу осаждают, спирт удаляют и осадок разводят до концентрации 10 млрд. микробных клеток в 1 мл солевым раствором, содержащим 0,5% фенола. Полученную взвесь бактерий окрашивают кристалвиолетом и используют для постановки реакции агглютинации.

Определение титра противораковых антител

Определение титра противораковых антител в сыворотке крови проводят с помощью реакции агглютинации на прозрачных пластинах с лунками в объеме 0,5 мл. Реакция ставится с испытуемыми сыворотками в пяти разведениях, а с контрольной сывороткой - до предельного титра. С этой целью в первую луночку вносят пипеткой 0,9 мл физиологического раствора (0,85% раствор поваренной соли с добавлением 0,5% фенола), во все последующие - по 0,5 мл этого же физ.раствора. Затем в первую луночку с 0,9 мл физ. раствора вносят 0,1 мл испытуемой сыворотки и также поступают с контрольной положительной сывороткой, перемешивают пипеткой и 0,5 мл смеси переносят во 2-ю луночку и т.д. до последнего разведения и из последней 0,5 мл выбрасывают. В результате получился ряд разведений сывороток: в первой 1:10, и далее 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 и т.д. В качестве отрицательного контроля в две луночки наливают по 0,5 мл того же самого физиологического раствора. В качестве контрольной положительной используют сыворотку, полученную от иммунизированных раковым или Л-антигеном животных. Затем в каждую луночку вносится по одной капле Л антигена (флакон с антигеном предварительно встряхнуть). Содержимое луночек перемешивают путем покачивания пластинок, закрывают пленкой или другим материалом, предохраняющим от высыхания содержимого луночек. И оставляют при комнатной температуре (+20)-(+28)°С на 20-24 часа. После чего учитывают результаты реакции. В положительных случаях образовавшийся агглютинат выпадает на дно луночки в виде ажурного, полупрозрачного зонтика, а отрицательных - весь антиген собирается в центре лунки в виде непрозрачного темного пятнышка.

Оценка реакции агглютинации: Исследование сыворотки крови проводят для выявления групп риска и контроля за эффективностью противораковой иммунизации. С этой целью исследования проводят до вакцинации и затем через 3-4 недели после вакцинации. У лиц с высоким уровнем иммунитета противораковые антитела обнаруживаются в сыворотке крови в титре 1:40 и выше. В этих случаях профилактическая вакцинация против рака не требуется.

У лиц пожилого возраста и имеющих иммунную недостаточность титры этих антител составляют 1:20 и ниже вплоть до отсутствия. Лица, имеющие титр 1:10 и нулевое значение, относятся к группе риска и подлежат обязательной иммунизации противораковой вакциной.

Примеры

1. Больная Е.И., 68 лет. Д-з: Рак правой молочной железы в начальной стадии. При первом исследовании по реакции агглютинации (РА) не реагировала, т.е. количество противораковых антител соответствовало нулевому значению. При исследовании крови через 25 дней после вакцинации титр в РА составил 1:20, через 5 месяцев после ревакцинации титр в РА составил 1:160, что соответствовало резкому улучшению общего состояния здоровья.

2. Больная Л.И., 63 г. Д-з: миома 3-4 нед. РА до прививки 1:10, после прививки 1:160.

3. Больная Л.П., 44 г. Д-з: миома 4-5 нед. РА до прививки 1:20, после 1:320.

4. Больная В.Я., 56 лет. Д-з: мастопатия. РА до прививки отрицательная, после прив. 1:80.

Изобретение касается антигена, используемого для определения качественного и количественного присутствия противораковых антител в исследуемом материале. Антиген по изобретению приготовлен на основе бактерий в стабильной нереверсивной Л-форме №118-Л2, имеющих антигенное родство с клетками злокачественных опухолей. Бактерии в Л-форме выделены из почвы, подвергнутой биотермическому обеззараживанию. Антиген предназначен для определения титра противораковых антител в крови с целью выявления среди населения групп риска и определения эффективности противораковой иммунизации.

Антиген для определения противораковых антител, отличающийся тем, что для его приготовления используют бактерии в стабильной нереверсивной Л-форме штамма №118-Л2, имеющего антигенное родство с клетками злокачественных опухолей и выделенного с помощью селективных питательных сред из почвы, подвергнутой биотермическому обеззараживанию.