СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТОНКОДИСПЕРСНОЙ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК МИКОБАКТЕРИЙ, ЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ К ИНФИЦИРОВАНИЮ МИКОБАКТЕРИОФАГАМИ Российский патент 2009 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к области частной микробиологии - микробиологии микобактерий, вирусологии (вирусы бактерий, или бактериофаги), санитарной и ветеринарной микробиологии, и может быть использовано в медицине и биотехнологии.

Изобретение представляет собой способ культивирования микобактерий в жидкой среде, включающий в ходе выращивания клеток ряд чередующихся последовательных пересевов культуры в жидкую питательную среду, содержащую детергент (один или несколько) в определенной и достаточной для образования гомогенной суспензии концентрации и затем в отсутствии таковых (1-2 пересева), так чтобы на конечной стадии полученная суспензия оказалась не только гомогенной, но и чувствительной к микобактериофагу.

Предлагаемая процедура культивирования проста в исполнении и позволяет выращивать бактерии в виде взвешенной, однородной по всему объему суспензии (тонкодисперсная суспензия), что дает возможность проводить с ней самые разные эксперименты в области генной инженерии, микробиологии, в том числе и эксперименты с использованием микобактериофагов. При таком способе культивирования в жидкой среде микобактерий сначала теряют чувствительность к микобактериофагу, одновременно теряя способность к ветвлению, а затем при проведении последующих пересевов восстанавливают чувствительность к бактериофагу, при этом суспензия клеток в течение как минимум 1-2-х пересевов остается в тонкодисперсном состоянии.

Настоящее изобретение может оказаться востребованным и в биотехнологии, поскольку после пересева и последующего культивирования при отсутствии детергента(ов) полученная суспензия свежевыращенной культуры клеток, оставаясь по-прежнему в тонкодисперсном состоянии и восстанавливая фагочувствительность, может быть использована для наработки (культивирования) в жидкой среде олиговидоспецифичных микобактериофагов - специфичных одновременно, например, к бактериям вида М. smegmatis, являющимся не патогенным для человека и животных видом микобактерий, и к любому другому виду микобактерий, патогенному или условно патогенному для человека или животных, например, М tuberculosis, М. bovis, М. leprae, М. fortuitum, М. ulcerans, М. chelonae и др. Как следствие, изобретение может оказаться полезным и для медицины, поскольку осуществление промышленного культивирования микобактериофагов, видоспецифичных к патогенным и условно патогенным видам микобактерий на восприимчивой к ним непатогенной культуре - М. smegmatis - позволит расширить исследования, связанные с фаготерапией микобактериальных заболеваний человека и животных вообще и туберкулеза и лепры в частности.

Из всего разнообразия грамположительных бактерий микобактерий выделены в отдельный род Mycobacterium. Среди представителей этого рода существуют сапрофитные (условно патогенные и непатогенные) и патогенные виды. Последние вызывают такие социально опасные заболевания, как туберкулез, лепру; некоторые сапрофитные виды - микобактериозы. Культивирование бактерий, содержащих в поверхностном слое миколовые кислоты, особенно микобактерий, в жидкой среде осложняется тем; что по причине большой протяженности углеводородной цепи миколовых кислот (С60-С90) (у других родов - меньшей протяженности), имеющих гидрофобный характер, клетки обладают высокой адгезией (прилипанием) по отношению к стеклянным и металлическим поверхностям. Поэтому промышленное культивирование бактерий данного рода в настоящее время отсутствует.

Другой весьма важной особенностью микобактерий, создающей серьезные трудности при культивировании в жидкой среде, является их способность к ветвлению, что приводит к образованию крупных скоплений клеток различного размера (результат - получение полидисперсной культуры) и быстрому оседанию их в случае остановки процесса перемешивания, а значит, и затруднениям при проведении дальнейших операций с полученной культурой (пересев, электропорация).

Одним из способов для преодоления этой проблемы является культивирование микобактерий в присутствии детергентов. Пожалуй, единственным детергентом на сегодняшний день выступает неионогенный детергент твин 80, примененный Дюбо Р. и Дэвисом Б. в 1946 г.[1]. Предложенный первоначально для быстрого выращивания чистых культур М. tuberculosis и близких к ним микроорганизмов неионогенный детергент добавляли к ростовой среде в концентрации 0,02%. Позднее в других исследованиях [2] его концентрация была увеличена на порядок - до 0,2%. Однако культура клеток микобактерий, полученная в присутствии детергента, не могла быть использована в экспериментах, связанных с инфицированием ее микобактериофагами. Причиной тому являлось снижение эффективности адсорбции микобактериофага на поверхности клеточной стенки микобактерий, которые выращивались в среде с твином 80, что приводило к частичной или полной потере чувствительности культуры к микобактериофагу [2].

В настоящее время выращивание культур микобактерий, в частности М. smegmatis и М. bovis BCG, как наиболее изученных, которые используются в качестве биобезопасных индикаторных культур для первичного отбора микобактериофагов из различных объектов окружающей среды или для их обнаружения, проводится способом, описанным в руководстве G. Sarkis & G. Hatfull [3, прототип]. Согласно данному руководству, микобактерий сначала культивируют в среде, основой для которой является триптический соевый бульон, в присутствии 0,2% твина 80 в течение ночи при 37°С и интенсивном встряхивании. После достижения культурой состояния поздней лог-фазы (ПО₆₀₀ выше 1,5), ей дают отстояться 5 мин для осаждения крупных скоплений клеток, которые образуются вследствие ветвления клеток. Мелкодисперсную фракцию полученной ночной культуры микобактерий пересевают в среду Миддлбрука 7Н9, включающую одну из ростовых добавок ADC или OADC, но не содержащую детергента, и продолжают культивирование в тех же условиях. Культуру М. smegmatis, полученную описанным способом, используют в экспериментах, проводимых с микобактериофагами, с последующим высевом на твердую среду.

Существенным недостатком описанного способа культивирования микобактерий является в первую очередь образование скоплений клеток вследствие их ветвления в ходе роста. Именно это обстоятельство препятствует точному дозированию клеточной массы при постановке однотипных экспериментов, например, одновременный засев большого числа пробирок, когда требуется проведение инфицирования культуры различными разведениями микобактериофага: из-за разного количества клеток, попадающих при пересеве в жидкую среду, изменяется посевная доза, а при работе с микобактериофагом - множественность заражения.

Второе обстоятельство, затрудняющее работу с полученной культурой, - это адгезия клеток микобактерий на стеклянных, металлических и даже пластмассовых поверхностях. В этом случае после очередного встряхивания (суспендирования) часть клеток выводится из суспензии, вследствие чего посевная доза при пересеве культуры также будет являться переменной величиной. Кроме того, прилипание клеток к поверхностям, вызывает материальные потери, поскольку большая часть культуры не может быть использована в эксперименте, и выбрасывается.

Еще одним недостатком способа-прототипа является использование второй питательной среды при пересеве и культивировании микобактерий М. smegmatis при отсутствии детергента для восстановления чувствительности к микобактериофагам. При этом используют только среду Миддлбрука 7Н9, в которую вносят дорогостоящие ростовые добавки ADC или OADC [4]. Это не технологично и очень затратно.

Технической задачей изобретения является разработка способа получения тонкодисперсной, однородной по всему объему культуры клеток микобактерий, чувствительной к инфицированию микобактериофагами, в одной питательной среде.

Поставленная задача решается путем подбора концентрации детергента, при которой получалась бы культура микобактерий, имеющая высокую седиментационную устойчивость и одновременно проявляющая гидрофильность, и затем после пересева и культивирования при отсутствии детергента сохраняющая гидрофильность и восстанавливающая способность к адсорбции микобактериофага.

Для этого проводят параллельное культивирование одновременно засеянных культур микобактерий М. smegmatis из предварительно одиночно полученной суспензии этой же культуры, образцы которых представляют собой ряд пробирок с питательной средой, при этом очередная пробирка содержит дискретно возрастающую концентрацию детергента, обладающего как ионогенными (лауроилсаркозинат натрия), так и неионогенными свойствами (твин 80, твин 20, спан 85), начиная с 0,05% с шагом 0,05% вплоть до 0,5%.

Еще одним аспектом изобретения является подбор состава питательной среды для культивирования М. smegmatis в качестве единственной для проведения исследований на любом этапе как на твердой, так и в жидкой среде, содержащей традиционно используемые компоненты и имеющиеся в наличии в любой микробиологической, бактериологической и молекулярно-биологической лаборатории.

Имеющиеся в арсенале бактериологов среды для культивирования микобактерий вне организма человека с момента обнаружения микобактерий, вызывающей туберкулез, разрабатывались с одной главной целью - выявление патогенных микобактерий вида М. tuberculosis, М. bovis и М. leprae, тех видов, которые вызывают социально опасные заболевания. Это хорошо известные среды: жидкие - Дюбо, Миддлбрука, Киршнера, Сотона и др., твердые -Левенштейна - Йенсена, Финна 2, Школьниковой, Миддлбрука, Пейзера и др., а также модификации и первых и вторых. Есть среди известных и запатентованные отечественные среды [5, 6, 7, 8, 9]. Однако все эти среды включают большое количество органических и(или) неорганических компонентов в виде солей, что усложняет их приготовление. Кроме того, некоторые из них содержат нестандартизованные компоненты или не поддающиеся стандартизации, например, оксидат торфа и 1,5%-ную вытяжку древесной золы [5, 9], криалл [9].

М. smegmatis является сапрофитным видом из рода Mycobacterium, a значит, способна расти на более простых средах [3] в отличие от патогенных М. tuberculosis и М. bovis. С обнаружением в клинических изолятах больных (у иммунонекомпетентных или иммуносупрессивных лиц) условно патогенных микобактерий других видов (М. fortuitum, М. ulcerans, М. scrofulaceum и др.) их также стали выращивать на средах, предназначенных для культивирования М. tuberculosis. Такое культивирование затратно для выращивания сапрофитных видов микобактерий, даже в лабораторных условиях. Кроме того, отсутствие в питательной среде твина 80, хотя и обеспечивает в отдельных средах обильный и быстрый рост микобактерий М. tuberculosis, а значит, и М. smegmatis, на выходе приводит к получению полидисперсной культуры.

Известно, что растительные белки как компонент питательных сред в отличие от белков животного происхождения менее сбалансированы по аминокислотному составу, в частности обеднены так называемыми незаменимыми аминокислотами. Выбор компонентов животного происхождения для питательной среды обусловлен также тем обстоятельством, что некоторые питательные среды, используемые для культивирования микобактерий М. tuberculosis, содержат как дополнительный компонент лошадиную сыворотку [9], яичный желток (среда Пейзера) и(или) цельное куриное яйцо (среда Левенштейна - Йенсена, Финна 2, Гельбера), экстракт кормовых дрожжей и гидролизат казеина [7] или гидролизат казеина (среда Дюбо), пептон и снятое коровье молоко (среда Гельбера) - все продукты животного происхождения.

Именно по этой причине разработчики отказались от использования триптического соевого бульона (продукт растительного происхождения), который является основой для приготовления питательной среды, используемой на первом этапе культивирования микобактерий вида М. smegmatis в способе-прототипе.

Проанализировав составы сред (богатые, полусинтетические и синтетические) для выращивания микобактерий вида М. tuberculosis, авторы предлагаемой разработки выбрали в качестве наиболее подходящей известную среду 2×YT, или YT (2×YT (г/л), которая содержит в качестве основных органических компонентов дрожжевой экстракт и триптон, а в качестве неорганического компонента - хлорид натрия, при следующем содержании компонентов (г/л): дрожжевой экстракт - 10, триптон - 16, NaCl - 5; или YT (г/л): дрожжевой экстракт - 5, триптон - 8, NaCl - 5 [10, прототип].

Взяв за основу указанный состав питательной среды, разработчики в качестве неорганического компонента в дополнение к хлориду натрия ввели гидрофосфат калия, являющийся для большого количества сред, разработанных для культивирования микобактерий обязательным компонентом для усиления роста.

В качестве энергетического источника и углеродного компонента среды, разработчики используют глюкозу вместо глицерина [3]; при этом концентрацию глюкозы в среде доводят до 2-4%, что в 10-20 раз выше, чем в традиционно используемых средах (среда Луриа - Бертани, YT и др.) для культивирования энтеробактерий, например, Е. coli [10]. В присутствии столь высокой концентрации глюкозы наблюдается обильный рост клеток микобактерий М. smegmatis. Полученную среду, приготовленную как двукратную, условно назвали 2×YTMyc.

Состав основной среды для приготовления питательной среды для культивирования микобактерий М. smegmatis как индикаторной культуры приведен ниже:

Среда 2×YTMyc состава (г/л): дрожжевой экстракт - 10, триптон - 30, NaCl - 10, K₂HPO₄ - 5.

Предложенная концентрированная среда 2×YTMyc не включает глюкозу, хлористый кальций, антибиотики, детергенты. Эти компоненты добавляются по окончании стерилизации среды или непосредственно перед приготовлением рабочей среды YTMyc41 или YTMyc21 путем разбавления 2×YTMyc, где цифрами обозначены конечные концентрации в получаемой питательной среде глюкозы (4% и 2% соответственно) и хлорида кальция (1 мМ).

Состав питательной среды YTMyc41 состава (г/л): дрожжевой экстракт - 5, триптон - 15, NaCl (натрия хлорид) - 5, К₂HPO₄ (калия гидрофосфат) - 2,5, глюкоза - 40, CaCl₂ (кальция хлорид) - 0,111.

Состав питательной среды YTMyc21 состава (г/л): дрожжевой экстракт - 5, триптон - 15, NaCl (натрия хлорид) - 5, K₂HPO₄ (калия гидрофосфат)-2,5,глюкоза - 20, CaCl₂ (кальция хлорид) - 0,111.

При составлении питательной среды YTMyc41 при необходимости вносят антибиотики (ампициллин, амфотерицин В и др.) и детергенты (твин 80, твин 20, спан 85, лауроилсаркозинат натрия (SLS), и др.).

Добавление ионогенного ПАВ, в частности лауроилсаркозината натрия, в концентрации не более 0,04%, преимущественно в диапазоне 0,01-0,03%, наряду с твином 80 в диапазоне 0,25-0,5% позволяет получить культуру микобактерий М. smegmatis в виде эмульсионной формы с высокой седиментационной и агрегативной устойчивостью в сравнении с культурой, полученной в случае культивирования при отсутствии лауроилсаркозината натрия, но в присутствии твина 80. При внесении лауроилсаркозината натрия в питательную среду в концентрации свыше 0,03% наблюдается значительное снижение скорости роста культуры до полного прекращения при концентрации свыше 0,04%.

Предлагаемый способ получения тонкодисперсной культуры микобактерий состоит в следующем.

В микробиологическую пробирку вносят последовательно 250 или 500 мкл 40%-ного раствора глюкозы, 50 мкл 0,1 М раствора CaCl₂ (при необходимости в среду вносят растворы антибиотиков и/или химиопрепаратов), 2,5 мл готовой среды 2×YTMyc, 63-125 мкл 20%-го водного раствора детергента, например твина 80, и доводят до 5 мл стерильной дистиллированной водой. В подготовленные пробирки с 5 мл среды вносят небольшое количество клеток микобактерий М. smegmatis и инкубируют при 37°С на качалке при скорости вращения 200 об/мин в течение 2-4 суток (время культивирования зависит от планируемого эксперимента). Полученную эмульсионную форму культуры пересевают в отношении 1:50 в свежую питательную среду 2×YTMyc41 или YTMyc21 без детергента и продолжают культивирование при тех же условиях в течение суток. Затем снова пересевают в отношении 1:50 (получение культуры для инфицирования микобактериофагом) или 1:25 (получение культуры для приготовления газона) и продолжают культивирование в тех же условиях в течение 1 или 2-х суток соответственно.

Сущность изобретения состоит в том, что для получения тонкодисперсной культуры микобактерий в жидкой среде используют повышающиеся дискретно концентрации детергента, начиная с 0,05%, с шагом 0,05%, вплоть до 0,5%. Показано, что, начиная с концентрации 0,25% в ростовой среде, культура становится тонкодисперсной, причем угнетения роста культуры клеток вплоть до 0,5% практически не наблюдается. Более того, культура клеток приобретает гидрофильный характер и не сорбируется на стеклянной поверхности. Такое состояние культуры мы назвали «эмульсионной формой» в отличие от тонкодисперсного состояния, которое приобретает (сохраняет) культура впоследствии после пересева ее и последующего культивирования при отсутствии детергента в среде этого же состава.

Предложенное техническое решение отличается от прототипа тем, что культуру клеток микобактерий М. smegmatis не частично, а полностью переводят в тонкодисперсное состояние (культура не содержит скоплений клеток, по виду напоминает культуры различных лабораторных штаммов Е. coli, используемых в генной инженерии) путем культивирования ее клеток с более высокой концентрацией детергента (0,25-0,5%), что позволяет проводить точное дозирование полученной культуры при осуществлении самых различных экспериментов в генной инженерии, бактериологии, генетике микобактерий без потери клеточного материала.

Другим отличием от прототипа является то, что культивирование клеток микобактерий, преимущественно вида М. smegmatis, на протяжении всего цикла приготовления культуры, в особенности для экспериментов с микобактериофагом, проводится в одной-единственной среде, которая постоянна по своему составу и содержит в качестве ингредиентов продукты животного происхождения.

Таким образом, нами показано, что при культивировании грамположительных бактерий, несущих в поверхностном слое клетки миколовые кислоты (микобактерий), могут быть использованы как неионогенные, так и ионоактивные (анионо- и катионо-) ПАВ, а также их сочетание, с целью придания гидрофобной поверхности гидрофильного характера в концентрациях, не подавляющих рост культуры.

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.

Пример 1. Приготовление питательной среды YTMyc41. Рабочую питательную среду (например 40 мл) готовят смешиванием 20 мл 2xYTMyc, 4 мл 40% глюкозы, 0,4 мл 100 мМ CaCl₂ и 15,6 мл стерильной дистиллированной воды. При составлении питательной среды YTMyc41 при необходимости вносят антибиотики (ампициллин, амфотерицин В и др.) и детергенты (твин 80, твин 20, спан 85, лауроилсаркозинат натрия (SLS) и др.).

Пример 2. Культивирование в жидкой среде микобактерий М. smegmatis в присутствии 0,25-0,5% твина 80. В стерильную микробиологическую пробирку объемом 20 мл или более вносят последовательно 500 мкл 40%-ного раствора глюкозы, 50 мкл 0,1 М раствора CaCl₂, 25 мкл раствора ампициллина (А) (50 мг/мл), приготовленного в 50%-ном водном этаноле (хранится в морозильной камере), и/или 25 мкл раствора амфотерицина В (Ар) (5 мг/мл), приготовленного в воде. В этом случае получается коллоидный раствор, который хранят при температуре 8-10°С (при этой температуре раствор желируется; перед использованием следует разогреть в руках или при 30-37°С до жидкого состояния). (Если пробирок засевается больше одной, то для сокращения рабочего времени рекомендуется сначала готовить общую смесь, содержащую все три-четыре постоянных вышеуказанных компонента с учетом числа пробирок на единицу больше, и расфасовывать по 575-600 мкл в каждую. После этого вносят по 2,5 мл готовой среды 2xYTMyc и 1,8 мл стерильной дистиллированной воды.) Для питательной среды, содержащей 0,25% твин 80 отдельно вносят 62,5-125 мкл 20%-го водного раствора твина 80, приготовленного заранее разведением коммерческого препарата. В подготовленные пробирки с 5 мл среды YTMyc41/A/(Ap)/(0,25-0,5) % твина 80 вносят небольшое количество клеток (размером с игольное ушко на петле), взятых с чашки, содержащей индивидуальные единичные колонии (не обязательно брать всю колонию). Инкубируют пробирки при 37°С на качалке при скорости вращения 200 об/мин в течение 1-А суток (время культивирования зависит от планируемого эксперимента).

Пример 3. Культивирование в жидкой среде микобактерий М. smegmatis в присутствии 0,25% твина 80 и 0,01% лауроилсаркозината натрия (SLS). Пробирки для засева готовят так же, как выше, с добавлением 62,5 мкл 20%-ного водного раствора твина 80, приготовленного заранее разведением коммерческого препарата, и 10 мкл 5%-ного водного раствора лауроилсаркозината натрия. Инкубируют пробирки при 37°С на качалке при скорости вращения 200 об/мин в течение 5-6 суток (время культивирования зависит от планируемого эксперимента). Чаще засев проводят при использовании выросшей культуры в присутствии 0,25%-ного твина 80 или твина 20 в отношении 1:50 (100 мкл «эмульсионной формы» культуры, выращенной в присутствии 0,25%-ного твина 80 или твина 20 вносят в 5 мл питательной среды YTMyc41/A/(Ap)/0,25% твина 80/ 0,01% SLS.

Пример 4. Культивирование в жидкой среде микобактерий М. smegmatis в присутствии 0,25% твина 20. Культивирование клеток в присутствии твина 20 проводят так же, как и в присутствии твина 80.

Пример 5. Культивирование в жидкой среде микобактерий М. smegmatis в присутствии 0,01% лауроилсаркозината натрия или при отсутствии детергента(ов). Культивирование проводят чаще пересевом 1:50 культуры, выращенной в присутствии 0,25-0,5% твина 80 и/или 0,01% лауроилсаркозината натрия, в свежую питательную среду YTMyc41/A/(Ap) или YTMyc41/A/(Ap)/0,01% SLS. Первое культивирование в отсутствие детергента (ов) приравнивается к одному пересеву. Через двое суток культивирования пересев при необходимости повторяют в дозе 1:50 или 1:25. Полученная культура, оставаясь в достаточной степени тонкодисперсной, восстанавливает чувствительность к микобактериофагу (в качестве контрольного служил микобактериофаг D29).

Пример 6. Приготовление чашек с твердой (агаризованной) средой, содержащей культуру М. smegmatis, чувствительную к микобактериофагу, или приготовление газонов с культурой М. smegmatis, чувствительной к микобактериофагу.

1-й вариант - газон в нижнем агаре. На поверхность каждой чашки Петри (диам. 90 мм) наносят 500 мкл 40%-ной глюкозы, 100 мкл раствора 0,1 М CaCl₂ и по 50 мкл ампициллина (А) (50 мг/мл ампициллина в 50%-ном водном этаноле) и амфотерицина В (5 мг/мл водного раствора), затем чашки прогревают в термостате до 37°С в течение 10-20 мин, быстро вносят 1 мл суспензии клеток микобактерий, предварительно нагретой до 37°С, и добавляют 8,3-8,5 мл охлажденного до 45-50°С нижнего агара, используя мерную пробирку на 10 мл, после чего тщательно перемешивают.

2-й вариант - газон в верхнем агаре. На поверхность каждой чашки Петри (диам. 90 мм) наносят 500 мкл 40%-ной глюкозы и по 50 мкл ампициллина (А) (50 мг/мл ампициллина в 50%-ном водном этаноле) и амфотерицина В (5 мг/мл водного раствора), затем чашки прогревают в термостате до 37°С, быстро добавляют 10 мл (точнее 9,4 мл) охлажденного до 45-50°С нижнего агара, используя мерную пробирку на 10 мл, после чего тщательно перемешивают. После отверждения агаризованной среды чашки помещают в термостат на 37°С на 10-20 мин.

300 мкл суспензии клеток микобактерий вносят в отдельную мерную пробирку на 10 мл, добавляют 30 мкл 0,1 М CaCl₂, ставят в термостат на 37°С или в термостатированную камеру, затем поочередно в каждую пробирку быстро добавляют верхний агар, охлажденный до 45-50°С, до объема 3 мл, перемешивают на вортексе и выливают на подогретую поверхность чашки с нижним агаром.

В обоих вариантах в качестве культуры может быть использована либо готовая «эмульсионная форма», либо тонкодисперсная культура, полученная после 1 -го или 2-го пересева.

Готовые газоны могут быть использованы для проведения спот-титрования суспензии бактериофага, преимущественно микобактериофага, или фаголизатов, содержащих бактериофаг, или суспензии бактериофага, получаемой в ходе очистки бактериофага на разных стадиях очистки. Культура для приготовления газонов, за исключением «эмульсионной формы», также может быть использована и при титровании бактериофага, преимущественно микобактериофага, до отдельных негативных колоний.

Пример 7. Использование культуры М. smegmatis для титрования микобактериофага до отдельных негативных колоний. В отдельной стеклянной, мерной, охлажденной пробирке на 10 мл смешивают 300 мкл охлажденной до 0-10°С суспензии культуры клеток микобактерий М. smegmatis, выращенных при отсутствии детергентов (1-й или 2-й пересев после культивирования в присутствии детергентов) в течение 20 ч - 2-х суток (1-й или 2-й пересев), и 50-100 мкл каждого из выбранных разведении микобактериофага. На дно охлажденной пробирки сначала вносят 300 мкл культуры клеток микобактерий, затем на стенки пробирки 50-100 мкл разведения суспензии микобактериофага и быстро встряхивают вручную или на вортексе так, чтобы бактериофаг распределился равномерно. Инкубируют при 37°С в течение 40-60 мин, переносят пробирки с инфицированной культурой в стерильное место, добавляют 30 мкл 0,1 М CaCl₂ и до 3,0 мл расплавленного и охлажденного до 45-50°С верхнего агара, быстро перемешивают на вортексе 2-3 раза с остановками и выливают на поверхность нижнего агара в чашке Петри, предварительно изъятой из термостата (если поверхность нижнего агара теплая, то верхний агар растекается быстро по всей его поверхности). Чашки с верхним агаром немедленно, до затвердевания его, ставят на ровную поверхность - по уровню. После затвердевания верхнего агара чашки переносят в термостат на 37°С, перевернув вверх дном, и инкубируют до формирования инфицированного газона.

Пример 8. Титрование культуры клеток М. smegmatis до отдельных колоний. Чтобы получить колонии микобактерий, выросшие из единичных клеток (это необходимо при проведении генетических экспериментов с целью отбора штаммов или выделения чистых культур), готовят разведения культуры (чаще 10-кратные) на среде YTMyc41 или любой другой, содержащей 0,03% лауроилсаркозината натрия, даже если культура была выращена при отсутствии этого детергента или при более низких концентрациях его. Высевают по 100 мкл на чашки Петри с нижним агаром. Чашки готовят, как описано ниже. На поверхность каждой чашки Петри (диам. 90 мм) наносят 500 мкл 40%-ной глюкозы и по 50 мкл ампициллина (А) (50 мг/мл ампициллина в 50%-ном водном этаноле) и амфотерицина В (5 мг/мл водного раствора), затем чашки прогревают в термостате до 37°С, быстро добавляют 10 мл (точнее 9,4 мл) охлажденного до 45-50°С нижнего агара, используя мерную пробирку на 10 мл, после чего тщательно перемешивают.

ЛИТЕРАТУРА

1. Dubos R.J. and Davis B.D. // Factors affecting the growth of tubercle bacilli in liquid media. - J. Exp.Med., - 1946. - V. 83, P.409-423.

2. McNerney R. // Meth. Mol. Medicine. - 2001. - Vol.54. - P. 145-154. - Totowa. - NJ. - Humana Press.

3. Sarkis G.J., Hatfull G.F. // Meth. Mol. Biology. - 1998. - Vol.101. - P.145-173. - Totowa. - NJ. - Humana Press.

4. Alcaide F., Gali N., Dominguez J., Berlanga P., Blanco S., Orus P., Martin R. // Usefulness of a new mycobacteriophage-based technique for rapid diagnosis of pulmonary tuberculosis. 2003. - J. Clin Microbiol. - V.41. - №7. - 2867 - 2871.

5. Патент RU №2192472, кл. C12Q 1/04, опубл. 2002 г.

6. Патент RU №2059715, кл. C12N 1/20, опубл. 1996 г.

7. Патент RU №2193061, кл. C12N 1/20, опубл. 2002 г.

8. Патент RU №2255974, кл. C12N 1/20, опубл. 2005 г.

9. Патент RU №2300559, кл. C12N 1/20, опубл. 2007 г.

10. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. - М.: Мир, пер. с англ. / Под ред. Алиханяна С.И., 1976 г.

Способ получения тонкодисперсной культуры клеток микобактерий, чувствительной к инфицированию микобактериофагами, включает первоначальное культивирование микобактерий в питательной среде в присутствии неионогенного детергента - твин 80 или твин 20, или спан 85 в количестве 0,25-0,5 мас.%, и/или ионогенного детергента лауроилсаркозинат натрия в пределах 0,01-0,03 мас.%. После одного или более пересевов культивирование ведут при отсутствии детергента, при этом культивирование клеток микобактерий на протяжении всего цикла проводят в питательной среде, содержащей, г/л: триптон - 15, дрожжевой экстракт - 5, глюкоза - 40, хлорид натрия - 2,5, гидрофосфат калия - 5, хлорид кальция - 0,111. Это обеспечивает повышение точности дозирования тонкодисперсной клеточной массы микобактерий при одновременном инфицировании бактериофагом большого числа образцов клеточной массы микобактерий и снижение трудоемкости процесса.

Способ получения тонкодисперсной культуры клеток микобактерий, чувствительной к инфицированию микобактериофагами, включающий первоначальное культивирование микобактерий в питательной среде в присутствии детергента с последующим после пересева культивированием на питательной среде в отсутствии детергента, отличающийся тем, что в качестве детергента на первом этапе культивирования используют неионогенный детергент твин 80 или твин 20, или спан 85 в количестве 0,25-0,5 мас.%, и/или ионогенный детергент лауроилсаркозинат натрия в количестве 0,01-0,03 мас.%, при этом культивирование клеток микобактерий на протяжении всего цикла проводят в питательной среде, содержащей, г/л: триптон 15, дрожжевой экстракт 5, глюкоза 40, хлорид натрия 2,5, гидрофосфат калия 5, хлорид кальция 0,111.