Способ определения вида бактериальной инфекции Советский патент 1985 года по МПК A61B10/00 

(О

С

Изобретение относится к медицине а именно к клинической микробиологии и иммунологии.

Цель изобретения - повьшение точности определения вида бактериальной инфекции и сокращение времени исследования.

Способ осуществляют следующим образом.

У больного забирают 10 мл венозной крови и помещают в силиконизИрованные пробирки, содержащие 250 БД гепарина (25 ЕД/мл). Осаждение эритроцитов производят путем отстаивания крови при 37°С в течение t ч после добавления 1 мл 10%-ного раствора желатины, В период осаждения эритроцитов готовят агарозный гель.

Приготовленный агарозньй гель раливают в пластмассовые лабораторные чашки Петри для однократного пользования, на дне которых находятся покровные стекла размером 24 24 мм Объем агарозного геля на одну чашку равен 3 мл. Для формирования лунок в агарозном геле применяется стандартный штамп, представляющий собой металлический (латунный) диск диаметром 40 мм и высотой 15 на нижней поверхности которого распо.лагаются 9 полых латунных стержней с наружным диаметром 2,4 мм. Стержни располагаются по строго перпендикулярно перекрещивающиеся линиям. При этом один из стержней находится в точке перекрещиваниялиний, а остальные стержни попарно располагаются на этих линиях. Расстояние между стержнями 2,4 мм. Высота стержней должна быть строго одинакова и не менее 1 см.

После приготовления чашек с агароаньм гелем последние помещают в эксикатор с углекислым газом. Экси,катор с чашечками вьщерживают до появления оранжевой окраски агарсзного геля. По окончании данной манипуляции чашки с агарозным гелем Считаипгся готовьми для определения хемотаксиса гранулоцитов под агарозоА.

Для получения взбеси лейкодатов образовавшееся после осаждения зритроцитов кольцо сыворотки осторожно удаляют из пробирки и наслаивают на 2 мл градиента плотности фи колл-верографин (d 1,077). После

центрифугирования при 1500 об/мин (400 g) в течение 20 мин образовавшиеся слой плазмы, слой фиколл-верографина и между ними слой мононуклеаров (лимфоциты и моноциты) удаляют. К оставшемуся на дне пробирки осадку, содержащему гранулогргты и примесь эритроцитов, добавляют 8 мл 0,83%-ного раствора хлористого аммония с целью разрушения эритроцитов. После ресуспенди| ования полученную взвесь гранулоцитов инкубируют в течение tO ют при . Далее гранулоциты отделяют от раствора хлористого аммония и элементов разрушенных эритроцитов путем трехкратного промывания в растворе Хенкса и центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 мин. Отмытые гранулоЦиты разводят в среде 199 до концентрации 10 клеток/мл.

В качестве хемоатрактантов используют взвесь чистых живых культур бактерий концентрации

10 бактерий/мл. Взвеси бактерий получаются путем смьша стерильной средой 199 суточных культур. Концентрация бактерий определяется по стандарту мутности.

После приготовления всех исходных ингредиентов (взвеси гранулоцитов, чашек с агарозным гелем, бактериальных хемоатрактантов) в центральную лунку вносят пастеровской пипеткой 0,02 мл среды 199. В средние лунки помещается суспензия гранулоцитов, а в крайние различные бактериальные хемоатрактанты. Ири этом на одной чашке с агарозным гелем становится возможньм изучение хемотаксиса одновременно к четырем предполагаемым видам возбудителей инфекции. Завершив описанный этап, эксикатор с чашечками и добавленньв 1 в него углекислым газом помещают в термостат на 3 ч при 37°С. По окончании этого срока для фиксации клеток к стеклу чашки заливают 47%-нь1м раствором формалина или метиловым спиртом . После 30-минутной фиксации слой агарозного геля удаляют и стекло промьшают в п;роточной воде.

Учет результатов осуществляют под микроскопом (увеличение 56) с помощью окулярного микрометра. Для этого измеряют две зоны миграции гракулоцитов: в сторону бактериаль

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИДА БАКТЕРИАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ, включакя ий вьщеление бактериальных клеток из патологического материала больных, отличающиеся тем, что, с целью повышения точно 1ти способа и сокращения времени исследования, дополнительно из крови того же больного выделяют гранулоциты и иссле- . дуют нх хемотаксическую активность по отношению к выделенный япвьм бактериям и при индексе хемотаксиса меньше одной условной единицы определяют вид бактериальной инфекции.