БИОТРАНСПЛАНТАТ НА ОСНОВЕ ПЕНОКЕРАМИЧЕСКИХ НОСИТЕЛЕЙ СИСТЕМЫ ОКСИД ЦИРКОНИЯ - ОКСИД АЛЮМИНИЯ И МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ПРОТЯЖЕННЫХ ДЕФЕКТОВ КОСТНОЙ ТКАНИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2010 года по МПК A61L27/10 A61K35/28 A61P19/00 

Изобретение предназначено для применения в регенеративной медицине с целью восстановления дефектов костной ткани, полученных в результате травматических и дегенеративных заболеваний.

Спектр используемых в настоящее время остеопластических матриц очень широк. Их основными требуемыми характеристиками являются биосовместимость, остеокондуктивность и достаточная механическая прочность. Введение в состав этих материалов клеточного компонента (остеобластов, стволовых клеток и т.д.) позволяет придать ему остеоиндуктивные свойства. Наибольший интерес для тканевой инженерии представляют мультипотентные стромальные клетки костного мозга (МСК), способные к дифференцировке в остеогенном, хондрогенном и адипогенном направлениях [1]. Введение клеток приводит к замещению утраченных клеточных элементов, индукции регенерации за счет выделения факторов роста и дифференцировки, формированию внеклеточного матрикса, что значительно ускоряет восстановление поврежденной ткани [2]. Иммобилизация культивированных клеток на матрице-носителе обеспечивает максимально высокую концентрацию клеток в области повреждения, дифференцировку в заданном направлении и повышает выживаемость клеток при трансплантации.

Деминерализованный костный матрикс (ДКМ) благодаря естественной архитектонике, остеогенному потенциалу, обусловленному наличием биологически активных веществ, является одним из наиболее популярных материалов для остеопластики. Показана эффективность применения носителей на основе ДКМ с иммобилизованными МСК при восстановлении дефектов теменных костей у крыс и собак [3]. Запатентована технология лечения ложных суставов с использованием биотрансплантата на основе ДКМ и аутологичных МСК [4]. Недостатками данного ксеногенного материала являются необходимость обработки агрессивными жидкостями (снижающими клеточную адгезию), потенциальная иммуногенность и возможность переноса возбудителей инфекционных заболеваний.

Широко используемые синтетические биодеградируемые носители на основе полимолочной и полигликолевой кислот и их сополимеров в сочетании с МСК также демонстрируют индукцию остеогенеза in vitro и формирование костной ткани через 6-9 недель в экспериментах на животных [5]. Мембраны из полилактидов и/или полигликолидов, импрегнированные хондроцитами или МСК костного мозга, запатентованы как способ лечения костных и хрящевых дефектов человека и животных [6]. Минусами таких носителей является быстрая и не всегда предсказуемая деградация матриц, которая сопровождается локальным понижением рН в области имплантата, что снижает эффективность их применения [7].

Требуемая механическая прочность матриц для регенерации костной ткани определяет использование нерезорбируемых носителей на основе керамики и сплавов различных металлов. Известно применение остеогенных МСК костного мозга, нанесенных на пористый каркас из сплава никелида титана, предварительно покрытый раствором коллагена, для моделирования репаративной функции губчатой кости [8].

Задачей настоящего изобретения является создание биотрансплантата (тканеинженерной конструкции) для восполнения протяженных дефектов костной ткани на основе пористого пенокерамического носителя системы оксид циркония - оксид алюминия и мультипотентных стромальных клеток костного мозга человека.

Предложенный нами носитель изготовлен из нерезорбируемой оксидной пенокерамики системы оксид циркония - оксид алюминия. Композитные матрицы на основе данных соединений, а также с добавлением гидроксиапатита и других компонентов характеризуются высокой биосовместимостью [9], отсутствием антигенной активности, значительной механической прочностью, а также остеокондуктивными свойствами [10]. Остеоиндуктивность обеспечивается введением в состав трансплантата мультипотентных стромальных клеток костного мозга человека.

Пенокерамические носители, полученные методом дублирования пенополиуретановой основы, характеризуются предельно высоким (85-95%) значением пористости, развитой лабиринтно-арочной структурой, состоящей из взаимосвязанных открытых пор размером 50-200 мкм. Такая структура носителя позволяет создать оптимальные условия как для культивирования клеток, обеспечивая достаточный газообмен и снабжение питательными веществами, так и для формирования костной ткани in vivo. Микропористая поверхность матрицы благодаря адсорбции биологически активных макромолекул обеспечивает эффективное прикрепление и распластывание клеток. Значительная пролиферативная активность культивируемых на поверхности пенокерамических носителей МСК позволяет за короткий срок (7 суток) получить матрицу размером 5×5×5 мм, плотно заселенную жизнеспособными, функционально активными клетками.

Полученная тканеинженерная конструкция (ТИК) не является токсичной для окружающих тканей, т.к. материал не обладает цитотоксическим действием. Остеогенный потенциал адгезированных на поверхности носителя МСК определяет остеоиндуктивные свойства конструкции. Формообразующая функция ТИК обеспечивается механической прочностью матрицы.

Получение пенокерамического носителя

Высокопористый керамический материал с ячеистой структурой (открытоячеистую пенокерамику) получали способом дублирования пенополиуретановой основы. Этот метод позволяет получать материал с предельно высоким (85-95%) значением пористости, которая характеризуется развитой лабиринтно-арочной структурой, состоящей из взаимосвязанных открытых пор размером 50-5000 мкм. Технология изготовления включает в себя следующие операции.

1. Приготовление керамической суспензии с заданным содержанием порошков α-Аl₂O₃ и ZrO₂ и требуемым комплексом реологических характеристик; влажность суспензии в пределах 27-29%.

2. Вырезка заготовки из пенополиуретана марки ППУ-30-100 ТУ 6-05-5127-82 с заданным размером ячейки (число отверстий на линейный дюйм - 60 ppi).

3. Травление (активация) ППУ-заготовки.

4. Пропитка ППУ-заготовки керамической суспензией.

5. Удаление избытков керамической суспензии путем сжатия заготовки при степени деформации 85%.

6. Сушка заготовки на воздухе при 110°С в течение 4 часов.

7. Выжигание ППУ при 400°С в течение 1 часа.

8. Спекание в диапазоне температур (1600-1700)°С в течение 1 часа.

9. Финишная обработка.

Термообработка порошков системы оксид алюминия - оксид циркония в температурном интервале (100-1000)°С приводит к уменьшению удельной поверхности порошков со (180-230) до (32-50) м²/г и формированию кристаллической структуры порошков с появлением альфа и следов гамма фазы оксида алюминия и тетрагональной и моноклинной фазы оксида циркония.

Сформированный из порошков по предложенной технологий пористый каркас имеет однородное распределение пор по размерам, округлую форму перемычек, что хорошие предпосылки для формирования композиционного материала методом последующей пропитки. Полученый пенокерамический каркас пористостью 82-84% имеет предел прочности при сжатии около 50 МПа, что соизмеримо с прочностью пластинчатой костной ткани.

Для создания тканеинженерной конструкции используют образцы из биокерамики в виде трехмерных блоков размером 0,5×0,5×0,2 см с диаметром пор от 50 до 100 нм и РРI=60 (количество отверстий на линейный дюйм).

Получение культуры мультипотентных стромальных клеток (МСК)

Источником МСК является взвесь костного мозга, полученная путем эксфузии из заднего гребня подвздошной кости доноров.

Аспират костного мозга наслаивают на разделяющий градиент раствора фикола (плотность 1,077 г/мл) и центрифугируют при 1300 об/мин в течение 20 мин при +4°С. Интерфазное кольцо с ядросодержащими клетками отбирают и центрифугируют при 1100 об/мин в течение 10 мин при +4°С. Супернатант удаляют, а клеточный осадок суспендируют в культуральной среде (DMEM/F12 1:1 («ПанЭко», РФ) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки («HyClone-Perbio», США), 2 mМ L-глутамина («ПанЭко», РФ) и 0,5 мг/мл амикацина («Синтез АКО», РФ). Суспензию клеток рассевают на пластиковые чашки Петри (Nunclon) диаметром 90 мм в концентрации 10⁴ клеток на 1 мл и инкубируют при стандартных условиях (температуре 37°С, в условиях насыщающей влажности в атмосфере с 5% СО₂) Через 24 часа неприкрепленные клетки удаляют, а прикрепившиеся клетки промывают культуральной средой и инкубируют до достижения 75-85% конфлюентности. В дальнейшем смену среды проводят каждые 2-3 суток в зависимости от ростовых характеристик культуры. Первые колонии появляются через 7-10 суток. Анализируют динамику их роста и клеточную морфологию, и по результатам отбирают мелкоклеточные быстрорастущие колонии для дальнейшего размножения. Отобранные клетки инкубируют до достижения неполного монослоя (не более 50% конфлюентности) и вновь рассевают в той же плотности. Культивирование проводят до 3-4 пассажа до получения необходимого количества клеточной массы (в течение 4-5 недель).

На всех этапах выделения проводят иммунофенотипическую характеристику МСК по специфическим, сателлитным и негативным маркерам (виментин, CD 45, HLA-ABC, CD 29, CD 44, CD 49d, CD 71, CD 73, CD 90, CD 105, CD 106, CD 54) с помощью проточного цитофлуориметра FACS Caliber (“BD Biosciences”, США).

Подготовка матрицы-носителя

Пенокерамические носители подвергают стерилизации методом γ-облучения в дозе 2,5 Мрад. Данный способ стерилизации не вызывает изменений физико-механических и медико-биологических свойств. Затем носители промывают физиологическим раствором и высушивают в потоке воздуха.

Методика заселения образцов МСК

Подготовленные образцы помещают в 12 или 24-луночные планшеты (Nunk, Дания). Для приготовления клеточной суспензии МСК на 2-3 пассаже снимают с чашек Петри раствором трипсина-Версена, центрифугируют при 1100 об/мин в течение 10 мин при +24°С, осадок ресуспендируют в культуральной среде. Полученную суспензию с концентрацией клеток от 1 до 2 млн. в 1 мл среды наносят на образцы из расчета 100 мкл суспензии на 100 мг образца. Благодаря выраженным капиллярным свойствам носителя суспензия быстро проникает внутрь. Инкубируют в течение 60 мин при стандартных условиях для инициации прикрепления клеток к стенкам поровых каналов и добавляют культуральную среду. Через сутки образцы перекладывают в новые плашки. Смену культуральной среды проводят каждые два дня.

Оценка цитосовместимости матриц-носителей

Цитотоксичность образцов оценивают с помощью МТТ-теста, основанного на способности сукцинатдегидрогеназы митохондрий живых клеток восстанавливать светло-желтый МТТ тетразолиум (3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолиум бромид) до нерастворимого темноокрашенного формазана, экстрагируемого из клеток с помощью органических сольвентов (ДМСО). Результаты теста показали, что пенокерамические образцы системы оксид циркония - оксид алюминия не обладали токсическим действием в отношении МСК в системе in vitro. Отсутствие деградации носителя позволяет исключить вероятность токсического эффекта и в более продолжительных экспериментах in vivo.

Образцы, имеющие открыто-ячеистую структуру пористость 82-84% и шероховатый рельеф, характеризуются большой удельной площадью поверхности. Благодаря этому матрицы обладают выраженным капиллярным эффектом - клеточная суспензия, нанесенная на предварительно подготовленные образцы, незамедлительно проникает внутрь. Микропористая структура матрицы, образованная микрочастицами оксидных соединений (размером от 200 до 900 нм), способствует адсорбции из культуральной среды биологически активных макромолекул, которые стимулируют прикрепление и распластывание клеток. По данным электронной микроскопии клетки на пенокерамических носителях выглядят хорошо распластанными по поверхности матрицы, плотно прилегающими к ней. Таким образом, структурированная поверхность исследуемых образцов, как и ожидалось, является благоприятной основой для клеточной адгезии.

Количественная и визуальная оценка роста МСК выявила значительную пролиферативную активностью клеток при культивировании на поверхности пенокерамических носителей размером 5×5×5 мм. Среднее время удвоения МСК составило около 72 часов. Это позволяет за короткий срок (7 суток) получить матрицу, плотно заселенную клетками. Выживаемость клеток, культивированных в образцах, составляет не менее 95%. При этом распределение клеток в объеме носителя достаточно равномерное. Морфологически клетки, адгезированные в глубине носителя, не отличаются от расположенных на периферии - они имеют схожую вытянутую или полигональную форму и сильно распластаны. Данные результаты свидетельствуют об эффективном заселении носителей МСК по всему объему и хорошей выживаемости клеток в центральных областях, что позволяет предположить возможность относительно одновременного и эффективного формирования костной ткани в глубине и по периферии носителя.

Применение разрабатываемых ТИК для восполненя протяженных костных дефектов предполагает изготовление носителей различного размера и формы. Выбранная структура пенокерамических носителей и условия культивирования позволяют эффективно заселять и растить МСК на носителях диаметром 18 мм. Клетки внутри таких носителей морфологически не отличаются от культивируемых на образцах меньших размеров, также достаточно равномерно распределены по объему образца, а их выживаемость составляет около 90%. Таким образом, показана возможность эффективного культивирования клеток на расстоянии до 900 мкм от края носителя, а следовательно, оправдано изготовление трансплантатов для замещения дефектов толщиной до 18 мм. Следует отметить, что трансплантация ТИК таких больших размеров требует применения дополнительных методов индукции ангиогенеза с целью повышения выживаемости клеток in vivo.

Культивирование МСК на носителях размером от 5 мм до 18 мм в поперечном сечении осуществляется при стандартных условиях и не требует создания каких-либо дополнительных условий, например перфузии среды (как это рекомендовано при создании других тканеинженерных конструкций). Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что выбранная структура носителя с макропорами размером от 50 до 200 мкм обеспечивает достаточный газообмен и снабжение клеток питательными веществами, не требуя создания особых условий культивирования.

Общее время изготовления трансплантата от момента забора костного мозга до получения полностью заселенной МСК пенокерамической матрицы составляет в среднем около 6-7 недель и определяется концентрацией и пролиферативной активностью МСК в костномозговой взвеси и размерами носителя, задающими необходимое количество клеток для заселения.

Трансплантат представляет собой носитель, плотно заселенный МСК, культивированными от 1 до 3 пассажей, в глубине и по периферии. На одном носителе иммобилизовано от 200 до 500 тысяч клеток. Витальность, определяемая по исключению окрашивания 0,4% трипановым синим, составляет не менее 90%. Функциональная активность МСК подтверждается способностью к направленной дифференцировке в мезодермальные линии в индуктивных средах. С помощью иммунофенотипического анализа демонстрируется экспрессия стромальных маркеров CD90 и CD 105 у 60-90% клеток и отсутствие экспрессии маркера CD34.

Эффективность использования предложенной тканеинженерной конструкции

Экспериментальное исследование

Животные

В работе использовали половозрелых самцов беспородных крыс весом 180-200 г. Животных содержали на стандартной лабораторной диете. За 24 часа до проведения оперативного вмешательства животные не получали пищи. Проведено 3 серии экспериментов на 72 животных.

Экспериментальные модели

Разработанная методика операций во всех сериях опыта была одинаковой с соблюдением правил асептики.

Работа с лабораторными животными проводилась в соответствии с приказом Минздрава СССР №755 от 12.08.1977. На проведение экспериментального исследования было получено разрешение Комиссии по биоэтике ЗАО «Реметэкс» (Протокол №3 от 21.02.2008). Оперативные вмешательства проводили под эфирным наркозом, до и после операции животным вводили ненаркотические анальгетики.

Для изучения репаративных процессов костной ткани при трансплантации тканеинженерной конструкции дефект наносили в области свода черепа животных. Перед операцией шерсть с мозговой части черепа крысы состригали. В области теменных и межтеменной костей черепа производили разрез кожи длиной 3 см. Послойно рассекали фасции и мышцы, отводили в стороны и обнажали поверхность костей, тупым способом отслаивали надкостницу. Дефект костной ткани наносили в середине свода черепа, выпиливая с помощью круговой стоматологической фрезы округлое отверстие диаметром 7 мм, не повреждая твердую мозговую оболочку, признаком чего служило отсутствие обильного кровотечения из мозговых венозных синусов. Для остановки кровотечения из эндоста и губчатой кости применяли марлевые тампоны. В дно дефекта на поверхность твердой мозгвой оболочки накладывали тканеинженерную конструкцию (ТИК) или матрицу-носитель без клеток, так чтобы ее края плотно прилегали к краям дефекта, после чего дефект закрывали надкостницей и рану послойно ушивали. Наркоз и операцию, длившуюся 15-20 минут, все животные переносили удовлетворительно без ранних и поздних осложнений.

Для изучения репарации мягких тканей, неоангиогенеза, прорастания ТИК тканями реципиента ТИК вводили подкожно в области спины крысы. Для этого шерсть на спине животного состригали и делали два разреза, один в области холки, другой на 4 см каудальнее первого разреза. Тупым способом разводили фасции и погружали ТИК в оба сформированных ложа, после чего рану ушивали.

Серии экспериментов

В ходе исследования было проведено 3 серий экспериментов.

1. Группа 1а - в костный дефект черепа вводили ТИК (матрица-носитель на основе пенокерамики и предкультвированные на нем МСК), n=12.

2. Группа 1b - в костный дефект черепа вводили матрицу-носитель (на основе пенокерамики) без клеток, n=12.

3. Группа 2а - подкожно в области спины вводли ТИК (матрица-носитель на основе пенокерамики и предкультвированные на нем МСК), n=12.

4. Группа 2b - подкожно в области спины вводили матрицу-носитель (на основе пенокерамики) без клеток, n=12.

5. Группа 3а - подкожно в области спины вводли ТИК (матрица-носитель на основе полимолочной кислоты и предкультвированные на нем МСК), n=12.

6. Группа 3b - подкожно в области спины вводили матрицу-носитель (на основе полимолочной кислоты) без клеток, n=12.

Выведение животных из эксперимента во всех сериях проводили на 21 и 60 сутки наблюдения путем цервикальной дислокации под глубоким эфирным наркозом.

Анализ материала

В первой серии эксперимента выделенные объекты костной тани фиксировали в 10% нейтральном формалине и декальцинировали в 25% растворе Трилона Б. Заливку фрагментов полученных тканей в парафин и изготовление серийных срезов проводили по общепринятой методике. Срезы окрашивали по Маллори. Препараты исследовали с помощью микроскопа фирмы Zeiss Axioplan-2, фотосъемку проводили цифровой камерой Hitachi HV-C20A.

Для доказательства воспроизводимости повреждения костной ткани черепа для опытной и контрольной групп было определена суммарная площадь регенерата с помощью морфометрической программы Scion Image 3.0.

Использование однофакторного дисперсионного анализа продемонстрировало отсутствие статистически достоверных различий между группами (достигнутый уровень достоверности р=0,975). Таким образом, была показана воспроизводимость повреждения, что обусловило корректность сравнения долей структурных компонентов регенерата.

Для проведения морфометрического анализа на микрофотограммах в программе Scion Image 3.0 выделяли весь регенерат и его компоненты: ТИК, интегрированные с ТИК соединительную ткань и костную часть регенерата, внутри которой учитывали зрелый костный регенерат.

Площадь регенерата и каждого из компонентов регенерата определяли в пикселях и переводили в условные единицы (1 условная единица =10 пикселей).

Полученные значения величин площадей структурных компонентов регенерата соотносили с величиной его общей площади. Эти относительные величины использовали при статистической обработке материала, которую проводили с помощью программы Statistica 6.0.

Если распределение в подгруппе не соответствовало нормальному, проводили трансформацию данных. Для сравнения средних использовали критерий Стьюдента.

Результаты экспериментального исследования

Двадцать первые сутки наблюдения

В опытных и контрольных группах на 21 сутки после травматического повреждения в области дефекта уже не было выявлено гематомы и признаков воспалительной реакции. ТИК и регенерат целиком заполняли пространство между отломками. Края отломков, лишенные остеоцитов, подвергались активной резорбции.

Костная мозоль состояла из двух частей: соединительно-тканной и костной. Рыхлая неоформленная соединительная ткань располагалась между краями ТИК и материнской кости, при этом проростала в область расположения ТИК. Соединительная ткань в регенерате характеризовалась высокой плотностью пролиферирующих клеточных элементов. Клетки имели веретеновидную, полигональную или округлую форму и были окружены волокнистым межклеточным матриксом. Вокруг кровеносных сосудов располагались плотные скопления фибробластоподобных клеток, которые приобрели округлую и плоскую форму и образовывали неравномерно окрашенные первичные костные балки.

Структуры костного регенерата, расположенные беспорядочно между участками соединительной ткани, были представлены сетью костных трабекул. Ретикулофиброзная костная ткань занимала незначительную часть регенерата между ТИК и материнской костью. Поверхностные участки регенерата были представлены сеткой из незрелых костных трабекул с неравномерно окрашенным матриксом и рыхлой соединительной тканью и капиллярами кровеносных сосудов в межтрабекулярных пространствах. В опытной группе (1а) на этих сроках наблюдения регенерат в большей степени был представлен рыхлой волокнистой соединительной тканью и в меньшей степени костным регенератом, так же как и в контрольной группе, но в опытной группе участков ретикулофиброзной кости было больше. В более глубоких участках регенерата новообразованная костная ткань по мере утолщения костных трабекул подвергалась компактизации, уменьшалась плотность клеток в межклеточном веществе, и костный матрикс был более интенсивно окрашен.

Таким образом, на 21 сутки эксперимента во всех группах наблюдали активный интрамембранозный репаративный остеогенез. Дефект кости был полностью заполнен ТИК и плотно спаянным с ней регенератом, последний был представлен рыхлой соединительной тканью и ретикулофиброзной костной тканью. Различия между опытной и контрольной группами заключались в скорости репаративных процессов, то есть в динамике увеличения доли костной части регенерата и уменьшения доли рыхлой соединительной ткани.

Результаты морфометрического исследования также выявили статистически значимые межгрупповые различия.

В группе с введением в костную рану ТИК наблюдали интенсивное увеличение доли костной части регенерата (38,4±4,7% против 20,1±2,3%) при соответственном уменьшении доли соединительной ткани (62,2±9,7% против 81,3±12,1%) по сравнению с контрольной группой (р<0,0001). Отмечали также появление признаков компактизации кости, на некоторых срезах была выявлена зрелая компактная костная ткань, доля которой составила 1,78±0,8%, в то время как в контрольной группе она отсутствовала.

Таким образом, на основании данных морфометрического исследования можно утверждать, что на 21 сутки после травматического повреждения кости под влиянием введения матрицы-носителя с предкультивированными на ней МСК в костной ране происходит увеличение доли костной части регенерата и уменьшение доли соединительной ткани. Ускорение репаративных процессов выражается и в том, что в опытной группе на этом сроке появились признаки созревания костной мозоли.

Шестидесятые сутки наблюдения

На 60 сутки эксперимента, так же как и 21, в области травматического повреждения не было выявлено признаков отторжения трансплантата. Пространство между ТИК или матрицей-носителем было целиком заполнено регенератом. При этом отмечалось плотное прилегание костной ткани к поверхности имплантата с интерпозицией рыхлой волокнистой соединительной ткани и костной ткани. Что позволяет утверждать об эффективной остеоинтеграции между ТИК и материнской костью. Часть костного регенерата подвергалась активной резорбции, и кость приобретала физиологические форму и размеры исходной кости.

Костная мозоль на этих сроках большей частью состояла из костной ткани. Сохранялись лишь незначительные участки рыхлой соединительной ткани в межтрабекулярных пространствах ретикулофиброзной кости. Ретикулофиброзная костная ткань была представлена широкими мощными костными трабекулами, межтрабекулярные пространства в виде узких каналов, заполненных костным мозгом и кровеносными сосудами.

Вокруг кровеносных сосудов можно было видеть образование концентрически расположенных костных пластинок, которые более интенсивно окрашивались. У животных, которым вводили ТИК, таких участков с более интенсивно окрашенным костным матриксом было больше, что свидетельствует об активном созревании костного регенерата. По степени зрелости регенерат приближался к исходной кости, однако края отломков исходной кости до сих пор подвергались резорбции и еще можно было видеть пустые костные лакуны.

Таким образом, на 60 сутки эксперимента отмечалось восстановление структуры кости, регенерат практически полностью был представлен костной тканью, которая могла обеспечивать опорную функцию. Скорость репаративных процессов во всех группах снизилась, на первый план выступали процессы минерализации и ремоделирования костной ткани в соответствии с функциональной нагрузкой костного органа.

Через 2 месяца от начала эксперимента в опытной группе скорость репаративных процессов оставалась выше, чем в контрольной группе. В контрольной группе у некоторых животных по-прежнему наблюдали участки рыхлой волокнистой соединительной ткани (4,6±1,1%). Процессы ремоделирования костного регенерата в опытной группе протекали заметно быстрее, доля компактной костной ткани в этой группе составляла 57,3±7,9% против 31,5±4,6% в контрольной группе (р<0,0001). В контрольной группе межтрабекулярные пространства были заполнены костным мозгом, в опытной группе межтрабекулярных пространств оставалось уже существенно меньше, и они были представлены в виде узких каналов с проходящими в них кровеносными сосудами.

Выводы

1. Трансплантация в область дефекта костной ткани матрицы-носителя на основе пенокерамики системы оксидов циркония и алюминия не вызывает патологических изменений окружающих тканей и не вызывает изменений общего состояния крыс.

2. Трансплантированная матрица-носитель на основе пенокерамики системы оксидов циркония и алюминия эффективно приживается в области дефекта и интегрируется с окружающими костными тканями. Между трансплантатом и материнской костной тканью образуется полноценная костная ткань.

3. Трансплантация матрицы-носителя на основе пенокерамики системы оксидов циркония и алюминия с предкультивированными МСК костного мозга вызывает ускорение репаративных процессов и более эффективную остеоинтеграцию.

4. Полученные результаты служат экспериментальным обоснованием для применения аллогенных трансплантаций пренатальных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов при лечении обширных дефектов костной ткани в клинической практике.

Таким образом, предложенные для создания ТИК ПК-матрицы системы оксид циркония - оксид алюминия являются не токсичными для окружающих тканей, т.к. не обладают цитотоксическим эффектом. Благодаря своей структуре носители характеризуются высокой капиллярностью и адгезивностью, что обеспечивает эффективность их заселения МСК. Высокая пролиферативная активность позволяет за короткий срок получить носитель, плотно заселенный жизнеспособными, функционально активными клетками. При этом все эти характеристики сохраняются и у клеток, культивируемых на глубине до 900 мкм от поверхности носителя без создания дополнительной диффузии среды. Достаточная механическая прочность носителей и возможность моделирования необходимой формы определяет их применение для восстановления костных дефектов.

Использованная литература

Изобретение относится к медицине и представляет собой биотрансплантат на основе высокопористого керамического материала системы оксид циркония - оксид алюминия и мультипотентных стромальных клеток костного мозга человека для восстановления протяженных дефектов костной ткани, характеризующийся тем, что содержит аутологичные или донорские мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) из костного мозга и носитель, созданный на основе высокопористого керамического материала системы оксид циркония - оксид алюминия по технологии дублирования пенополиуретановой основы, при этом носитель плотно засевают ММСК, культивированными от 1 до 3-х пассажей, при этом на одном носителе иммобилизовано от 200 до 500 тысяч клеток, витальность которых составляет не менее 90%, а функциональная направленность подтверждается способностью к направленной дифференцировке в мезодермальные линии и демонстрируется экспрессия стромальных маркеров CD90 и CD 105 у 60-90% клеток и отсутствие экспрессии маркера CD34. Изобретение обеспечивает ускорение репаративных процессов и более эффективную остеоинтеграцию. 2 з. и 3 н.п. ф-лы.

1. Биотрансплантат на основе высокопористого керамического материала системы оксид циркония - оксид алюминия и мультипотентных стромальных клеток костного мозга человека для восстановления протяженных дефектов костной ткани, характеризующийся тем, что содержит аутологичные или донорские мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) из костного мозга и носитель, созданный на основе высокопористого керамического материала системы оксид циркония - оксид алюминия по технологии дублирования пенополиуретановой основы, при этом носитель плотно засевают ММСК, культивированными от 1 до 3 пассажей, при этом на одном носителе иммобилизовано от 200 до 500 тысяч клеток, витальность которых составляет не менее 90%, а функциональная направленность подтверждается способностью к направленной дифференцировке в мезодермальные линии и демонстрируется экспрессия стромальных маркеров CD90 и CD 105 у 60-90% клеток и отсутствие экспрессии маркера CD34.

2. Биотрансплантат на основе пенокерамических носителей системы оксид циркония - оксид алюминия и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека для восстановления протяженных дефектов костной ткани по п.1, характеризующийся тем, что в качестве носителя используют образцы из биокерамики в виде трехмерных блоков размером 0,5×0,5×0,2 см с диаметром пор от 50 до 100 нм и РР1=60 (количество отверстий на линейный дюйм), при этом проводят термообработку порошков системы оксид алюминия - оксид циркония в температурном интервале (100-1000)°С, что приводит к уменьшению удельной поверхности порошков со (180-230) до (32-50) м²/г и формированию кристаллической структуры порошков с появлением альфа и следов гамма фазы оксида алюминия и тетрагональной и моноклинной фазы оксида циркония, и, таким образом, сформированный из порошков по предложенной технологии пористый каркас имеет однородное распределение пор по размерам, округлую форму перемычек.

3. Биотрансплантат на основе пенокерамических носителей системы оксид циркония - оксид алюминия и мультипотентных стромальных клеток костного мозга человека для восстановления протяженных дефектов костной ткани по п.1, характеризующийся тем, что источником МСК является взвесь костного мозга, полученная путем эксфузии из заднего гребня подвздошной кости доноров.

4. Биотрансплантат на основе пенокерамических носителей системы оксид циркония - оксид алюминия и мультипотентных стромальных клеток костного мозга человека для восстановления протяженных дефектов костной ткани по п.1, характеризующийся тем, что представляет собой носитель, плотно заселенный МСК, культивированными от 1 до 3 пассажей, в глубине и по периферии.

5. Способ получения биотрансплантата на основе пенокерамических носителей системы оксид циркония - оксид алюминия и мультипотентных стромальных клеток костного мозга человека для восстановления протяженных дефектов костной ткани по п.1, характеризующийся тем, что полученный аспират костного мозга наслаивают на разделяющий градиент раствора фикола (плотность 1,077 г/мл) и центрифугируют при 1300 об/мин в течение 20 мин при +4°С, полученное таким образом интерфазное кольцо с ядросодержащими клетками отбирают и центрифугируют при 1100 об/мин в течение 10 мин при +4°С, при этом супернатант удаляют, а клеточный осадок суспендируют в культуральной среде (DMEM/F12 1:1, с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки или аутологичной сыворотки, 2 mM L-глутамина и 0,5 мг/мл амикацина, суспензию клеток рассевают на пластиковые чашки Петри в концентрации 10⁴ клеток на 1 мл и инкубируют при стандартных условиях (температуре 37°С, в условиях насыщающей влажности в атмосфере с 5% СO₂), затем неприкрепленные клетки удаляют, а прикрепившиеся клетки промывают культуральной средой и инкубируют до достижения 75-85% конфлюентности, в дальнейшем смену среды проводят каждые 2-3 суток в зависимости от ростовых характеристик культуры, при этом культивирование проводят до 3-4 пассажа до получения необходимого количества клеточной массы, при этом пенокерамические носители подвергают стерилизации методом γ-облучения в дозе 2,5 Мрад, затем носители промывают физиологическим раствором и высушивают в потоке воздуха, подготовленные образцы носителя вместе с полученной клеточной суспензией с концентрацией клеток от 1 до 2 млн в 1 мл среды наносят на образцы из расчета 100 мкл суспензии на 100 мг образца, при этом инкубируют в течение 60 мин при стандартных условиях для инициации прикрепления клеток к стенкам поровых каналов и добавляют культуральную среду, в течение суток образцы перекладывают в новые плашки, в последующем смену культуральной среды проводят каждые два дня.