ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ СЕЛЕКТИВНОГО НАКОПЛЕНИЯ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ, СУХАЯ (БУЛЬОН МОССЕЛЯ), ВАРИАНТЫ Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к санитарной и клинической микробиологии и может быть использовано для селективного накопления энтеробактерий из воды, пищевых продуктов, клинического материала и т.д.

Ведущие зарубежные фирмы: Merck «Микробиология», 2004-2005 стр.202; HiMedia (HiMedia Laboratories Pvt. Limited (Индия), 1993, стр.80; и ООО «ГЕМ» «Среды бактериологические». Каталог 2009-2010, стр.48, выпускают накопительный бульон для энтеробактерий по Мосселю на основе панкреатического гидролизата желатина или пептона мясного. Компонентное содержание в г/л представлено в табл.1.

Для бактериологического контроля в соответствии с Государственной Фармакопеей Российской Федерации, XII издание, регламентирующей перечень питательных сред для селективного обогащения энтеробактерий, предусмотрен бульон Мосселя (Enterobacteria Enrichment Broth-Mossel) ОФС 42-0067-07.

Селективное накопление всех видов энтеробактерий в бульоне Мосселя обусловлено тем, что высокая концентрация бычьей желчи в совокупности с бриллиантовым зеленым подавляет рост сопутствующей микрофлоры, а глюкоза способствует росту энтеробактерий. Натриево-калийные фосфаты обеспечивают большую буферную емкость в среде, что защищает культуру от губительного действия образующейся кислоты.

До настоящего времени в России в связи с отсутствием отечественной коммерческой сухой питательной среды для селективного обогащения энтеробактерий в практике клинической и санитарной микробиологии используется бульон Мосселя лабораторного приготовления, а для контроля микробиологической чистоты лекарственных сред - среда №3 (среда обогащения для бактерий семейства Enterobacteriaceae).

Недостатками бульона Мосселя лабораторного изготовления в соответствии с рецептурой, представленной в ГФ, XII издание, и среды №3 являются:

- сложность приготовления;

- использование в качестве элективного фактора неочищенной желчи крупного рогатого скота - вещества химически неопределенного состава, затрудняющего получение объективных результатов;

- отсутствие отечественных сухих препаратов - пептона и желчи, обладающих высокой степенью прозрачности в растворах;

- необходимость фильтрации в случае использования основных компонентов среды отечественного производства, как дополнительный этап в процессе приготовления;

- слабая ингибирующая способность в отношении сопутствующих грамположительных микробов ассоциантов при обеспечении роста энтеробактерий;

- увеличение себестоимости среды в случае необходимости использования импортных препаратов.

Наиболее близким к предлагаемому бульону Мосселя является коммерческий бульон Мосселя (Merck), который состоит из следующих компонентов, г/л:

Пептон мясной 10,0 Глюкоза моногидрат 5,5 Желчь бычья 20,0 Натрий фосфорнокислый   двузамещенный 8,0 Калий фосфорнокислый   однозамещенный 2,0 Бриллиантовый зеленый 0,015 pH готовый среды 7,2±0,2

Недостатком коммерческой среды (Merck) является:

- недостаточная эффективность при росте и селективном накоплении ряда энтеробактерий;

- недостаточно выраженные ингибирующие свойства в отношении микробов-ассоциантов;

- ограниченная доступность.

Задачей изобретения является создание отечественной сухой питательной среды для селективного накопления энтеробактерий, обладающей большей эффективностью, с более высокими селективными свойствами, обеспечивающей доступность и получение объективных результатов бактериологического контроля.

Поставленная задача решается тем, что предлагается питательная среда для селективного накопления энтеробактерий, сухая, содержащая белковую основу, глюкозу, калий фосфорнокислый однозамещенный и бриллиантовый зеленый, причем в качестве белковой основы она содержит панкреатический гидролизат рыбной муки, либо пептон мясной, либо панкреатический гидролизат рыбной муки и пептон мясной (в соотношении 1:1), желчь очищенную модифицированную (ЖОМ) и натрий хлористый при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:

Вариант первый:

Панкреатический гидролизат   рыбной муки сухой 8,0-12,0 Глюкоза 4,0-6,0 Натрий хлористый 2,0-2,8 Желчь очищенная модифицированная 30,0-34,0 Калий фосфорнокислый   однозамещенный 0,4-0,6 Бриллиантовый зеленый 0,01-0,02 pH готовый среды 7,2±0,2

Вариант второй:

Пептон мясной 8,0-12,0 Глюкоза 4,0-6,0 Натрий хлористый 2,0-2,8 Желчь очищенная модифицированная 30,0-34,0 Калий фосфорнокислый   однозамещенный 0,4-0,6 Бриллиантовый зеленый 0,01-0,02 pH готовый среды 7,2±0,2

Вариант третий:

Панкреатический гидролизат   рыбной муки сухой и пептон мясной 8,0-12,0 Глюкоза 4,0-6,0 Натрий хлористый 2,0-2,8 Желчь очищенная модифицированная 30,0-34,0 Калий фосфорнокислый   однозамещенный 0,4-0,6 Бриллиантовый зеленый 0,01-0,02 pH готовый среды 7,2±0,2

Технический результат достигается за счет предварительной подготовки сырой желчи. С этой целью нативную желчь КРС кипятят и фильтруют через фильтровальную ткань (бельтинг) в изоэлектрических точках, при каждом значении pH, с целью осаждения белков и высокомолекулярных пептидов. Заключительный этап подготовки желчи состоит из адсорбции примесей активным углем, внесения расчетного количества двузамещенного фосфата натрия в пересчете на содержание сухих веществ, кипячения и фильтрации. Это позволяет исключить дополнительное внесение фосфата натрия в состав среды, обеспечивая высокую буферную емкость готовой среды и ее прозрачность. Сбалансированность компонентного состава среды, включая панкреатический гидролизат рыбной муки (ПГРМ), в качестве белковой питательной основы, обеспечивает хорошие ростовые и селективные свойства бульона Мосселя.

Способ получения бульона Мосселя предусматривает смешивание сухих компонентов, г/л:

Панкреатический гидролизат   рыбной муки сухой, либо пептон   мясной, либо панкреатический   гидролизат рыбной муки   сухой и пептон мясной 8,0-12,0 Глюкоза 4,0-6,0 Натрий хлористый 2,0-2,8 Желчь очищенная модифицированная 30,0-34,0 Калий фосфорнокислый   однозамещенный 0,4-0,6 Бриллиантовый зеленый 0,01-0,02 pH готовый среды 7,2±0,2

Панкреатический гидролизат рыбной муки или пептон мясной обеспечивают ростовые потребности микроорганизмов в азотистом питании. Предварительная подготовка желчи КРС позволяет получить сухую желчь очищенную модифицированную (ЖОМ), обеспечивающую высокую буферную емкость и прозрачность готовой питательной среды, ингибирующие свойства в отношении нежелательной сопутствующей бактериальной флоры и селективное накопление энтеробактерий, не угнетаемое в результате образования кислых продуктов жизнедеятельности.

Отличием предлагаемой среды от прототипа является возможность использования наряду с пептоном мясным панкреатического гидролизата рыбной муки в качестве белковой основы. Технология подготовки сырой желчи с использованием натрия фосфорнокислого двузамещенного исключает дополнительное внесение его в среду. Количественное соотношение компонентов питательной среды, ее pH, обеспечивают среде сохранение хороших ростовых свойств, эффективность накопления энтеробактерий и ингибирующий эффект в отношении сопутствующей микрофлоры. Готовая среда сохраняет стерильность не менее 10 суток

Для достижения технического результата на стадии производства желчи очищенной модифицированной (ЖОМ) желчь после осаждения белков в изоэлектрических точках, адсорбции примесей активным углем с внесением двузамещенного фосфата натрия из расчета 12,0 г на каждые 20,0 г желчи, в пересчете на сухое вещество, сушат на сушильной установке в виброкипящем слое А1-ФМУ.

Пример 1. Для приготовления среды по первому варианту берут навески следующих ингредиентов, г/л:

Панкреатический гидролизат   рыбной муки сухой 8,0 Глюкоза 4,0 Натрий хлористый 2,0 Желчь очищенная модифицированная 30,0 Калий фосфорнокислый   однозамещенный 0,4 Бриллиантовый зеленый 0,01 pH готовый среды 7,2±0,2

Навески размешивают в 1 л дистиллированной воды, разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют автоклавированием при температуре 121°C в течение 5 мин.

Предлагаемая среда, прозрачная, зеленого цвета, обеспечивает рост и накопление следующих тест-штаммов семейства Enterobacteriaceae при посеве по 0,5 мл микробной взвеси из разведения 10^-7:

E. coli 25922

E. coli O55:K59 3912/41

S. flexneri 1a 8516

S. typhimurium 79

K. pneumonia 418

K. pneumonia 3534/51

Предлагаемая среда в значительной степени ингибирует рост грамположительных микроорганизмов, в частности S. aureus Wood-46, из разведения 10^-1.

Используемые для контроля среды тест-штаммы микроорганизмов получены из отдела коллекционных культур ФБУН ГНЦ ПМБ.

Готовят стандартную взвесь культуры каждого тест-штамма, соответствующую 10 единицам по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85 П, с использованием стерильного 0,9% раствора натрия хлористого. Полученные взвеси культур десятикратными разведениями (4,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида с 0,5 мл микробной взвеси) доводят до разведения 10^-7 (для S. aureus Wood-46 - до разведения 10^-1) и используют для контроля среды.

Для определения ростовых свойств засев производят по 0,5 мл микробной взвеси каждого из тест-штаммов из разведения 10^-7 в 5,0 мл бульона Мосселя, т.е. 10 м.к./мл среды. Посевы инкубировали при температуре (37±1)°C в течение 20-24 ч. Результаты биологического контроля лабораторных образцов бульона Мосселя на наборе тест-штаммов представлены в таблице 2.

Пример 2. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Панкреатический гидролизат   рыбной муки сухой 10,0 Глюкоза 5,0 Натрий хлористый 2,4 Желчь очищенная модифицированная 32,0 Калий фосфорнокислый   однозамещенный 0,5 Бриллиантовый зеленый 0,015 pH готовый среды 7,2±0,2

Результаты биологического контроля представлены в таблице 2 и аналогичны результатам проверки по примеру 1.

Пример 3. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Панкреатический гидролизат   рыбной муки сухой 12,0 Глюкоза 6,0 Натрий хлористый 2,8 Желчь очищенная модифицированная 34,0 Калий фосфорнокислый   однозамещенный 0,6 Бриллиантовый зеленый 0,02 pH готовый среды 7,2±0,2

Результаты биологического контроля представлены в таблице 2 и аналогичны результатам проверки по примеру 1.

Пример 4. Для приготовления бульона Мосселя в соответствии со вторым вариантом берут навески следующих ингредиентов, г/л:

Пептон мясной 8,0 Глюкоза 4,0 Натрий хлористый 2,0 Желчь очищенная модифицированная 30,0 Калий фосфорнокислый   однозамещенный 0,4 Бриллиантовый зеленый 0,01 pH готовый среды 7,2±0,2

Навески размешивают в 1 л дистиллированной воды, разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют автоклавированием при температуре 121°C в течение 5 мин.

Результаты биологического контроля представлены в таблице 3 и аналогичны результатам проверки примеров 1, 2, 3 по варианту 1.

Пример 5. Среду готовят в соответствии с примером 4.

Пептон мясной 12,0 Глюкоза 6,0 Натрий хлористый 2,8 Желчь очищенная модифицированная 34,0 Калий фосфорнокислый   однозамещенный 0,6 Бриллиантовый зеленый 0,02 pH готовый среды 7,2±0,2

Результаты биологического контроля представлены в таблице 3 и аналогичны результатам проверки примеров 1, 2, 3 по варианту 1.

Пример 6. Для приготовления бульона Мосселя в соответствии с третьим вариантом берут навески следующих ингредиентов, г/л:

Панкреатический гидролизат   рыбной муки сухой и пептон   мясной 8,0 Глюкоза 4,0 Натрий хлористый 2,0 Желчь очищенная модифицированная 30,0 Калий фосфорнокислый   однозамещенный 0,4 Бриллиантовый зеленый 0,01 pH готовый среды 7,2±0,2

Навески размешивают в 1 л дистиллированной воды, разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют автоклавированием при температуре 121°C в течение 5 мин.

Результаты биологического контроля бульона Мосселя в соответствии с вариантом 3 представлены в таблице 3 и аналогичны результатам проверки по примерам 1, 2, 3.

Пример 7. Среду готовят в соответствии с примером 6.

Панкреатический гидролизат   рыбной муки сухой и пептон   мясной 12,0 Глюкоза 6,0 Натрий хлористый 2,8 Желчь очищенная модифицированная 34,0 Калий фосфорнокислый   однозамещенный 0,6 Бриллиантовый зеленый 0,02 pH готовый среды 7,2±0,2

Результаты биологического контроля представлены в таблице 3 и аналогичны результатам проверки по примерам 1, 2, 3.

Пример 8. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Панкреатический гидролизат   рыбной муки сухой 6,0 Глюкоза 3,0 Натрий хлористый 1,6 Желчь очищенная модифицированная 28,0 Калий фосфорнокислый   однозамещенный 0,3 Бриллиантовый зеленый 0,005 pH готовый среды 7,2±0,2

Результаты биологического контроля представлены в таблице 2.

Оценка качества предлагаемой среды для селективного накопления энтеробактерий с нарушением количественного соотношения ингредиентов:

Пример 9. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Панкреатический гидролизат   рыбной муки сухой 14,0 Глюкоза 7,0 Натрий хлористый 3,2 Желчь очищенная модифицированная 36,0 Калий фосфорнокислый   однозамещенный 0,7 Бриллиантовый зеленый 0,025 pH готовый среды 7,2±0,2

Результаты биологического контроля представлены в таблице 2. Нарушение количественного соотношения ингредиентов среды в примерах 8, 9 ведет к ухудшению ростовых, ингибирующих свойств и, как следствие, снижению коэффициента эффективности накопления энтеробактерий.

Из таблиц сравнительных характеристик биологического контроля (табл.2, 3) видно, что предлагаемая питательная среда в соответствии с примерами 1-7 обладает хорошими ростовыми свойствами, эффективна в накоплении энтеробактерий и подавляет рост стафилококка.

Визуальный учет результатов накопления энтеробактерий по окончании срока инкубации посевов показал идентичные результаты в испытуемых и контрольной средах.

Изменение количественного соотношения компонентов среды ведет к нарушению биологических показателей качества предложенной среды.

Так, в случае приготовления среды в соответствии с примерами 8, 9 наблюдается снижение эффективности накопления энтеробактерий и ингибирующего эффекта среды в отношении S. aureus Wood-46.

Для получения данных по показателю эффективности бульона Мосселя засеянные пробирки каждого тест-штамма, содержащие около 10 м.к./мл - (нулевой посев) инкубировали при температуре (37±1)°C в течение 3 ч. Для определения посевной дозы 0,1 мл микробной взвеси каждого тест-штамма из разведения 10^-7 высевали на чашки Петри с ГРМ агаром. После инкубации посевов в накопительной среде содержимое пробирок перемешивали и производили аналогичный высев на ГРМ агар.

Через 18-20 часов инкубации посевов на ГРМ агаре при температуре (37±1)°C производили подсчет сформировавшихся колоний. Показатель эффективности рассчитывали по приросту числа колоний после инкубации культуры в накопительной среде к числу колоний при нулевом посеве.

Сравнительная характеристика эффективности бульона Мосселя по варианту 1 представлена в таблице 3. Результаты эффективности накопления энтеробактерий бульона Мосселя, приготовленного в соответствии вариантами 2, и аналогичны и сопоставимы с результатами, полученными при испытании бульона Мосселя, вариант 1.

Таким образом, разработана отечественная конкурентоспособная сухая питательная среда для селективного обогащения энтеробактерий, имеющая ряд преимуществ:

эффективность накопления энтеробактерий в 1,5-2,0 раза выше, чем в коммерческой среде;

коэффициент ингибиции в отношении стафилококка более чем в 100 раз превышает показатель коммерческого накопительного бульона;

питательная среда проста в приготовлении;

разработана технология осветления желчи в изоэлектрических точках с использованием активного угля и двузамещенного фосфата натрия, исключающая дальнейшее внесение его в питательную среду, обеспечивающая прозрачность готового препарата;

исключена необходимость использования безводного натрия фосфорнокислого двузамещенного при изготовлении сухого препарата;

возможность использования панкреатического гидролизата рыбной муки наряду с пептоном мясным при сохранении ростовых и селективных свойств;

Таблица 1 Накопительный бульон для энтеробактерий по Мосселю № п/п Наименование компонентов Накопительный бульон для энтеробактерий по Мосселю (Бульон Мосселя) Merck ЭО бульон Мосселя ЕЕ Broth, Mossel HiMedia Энтеробактериальный бульон обогащения по Мосселю ООО «ГЕМ» Бульон Мосселя для обогащения энтеробактрий (Enterobacteria Erichment Broth-Mossel ОФС 42-0067-07) 1 Панкреатический гидролизат желатина - - 10,0 10,0 2 Пептон мясной 10,0 10,0 - - 3 Глюкоза моногидрат 5,5 5,0 5,0 5,0 4 Желчь бычья 20,0 20,0 20,0 20,0 5 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 8,0 6,45 7,0 8,0 6 Калий фосфорнокислый однозамещенный 2,0 2,0 3,0 2,0 7 Бриллиантовый зеленый 0,015 0,0135 0,015 0,015               pH готовый среды 7,2±0,2 7,2±0,2 7,2±0,2 7,2±0,2

Таблица 2 Сравнительная характеристика биологического контроля бульона Мосселя на основе панкреатического гидролизата рыбной муки, г/л № п/п Наименование тест-штамма Разведение Вариант 1 Вариант 1 Вариант 1 Вариант 1 Вариант 1 Накопительный бульон для энтеробактерий по Мосселю (Бульон Мосселя) Merck Пример 1 Пример 2 Пример 3 Пример 8 Пример 9 1 E. coli 25922 10^-7 +++ +++ +++ ++ ++ +++     10^-6 +++ +++ +++ +++ +++ +++ 2 E. coli 055:K59 10^-7 +++ +++ +++ ++ ++ +++ осадок   3912/41 10^-6 +++ +++ +++ +++ +++ +++ 3 S. flexneri la 8516 10^-7 ++ ++ ++ + + ++ 10^-6 ++ ++ ++ ++ + +++ 4 S. typhimurium 79 10^-7 +++ +++ +++ ++ ++ +++ 10^-6 +++ +++ +++ +++ ++ +++ 5 K. pneumonia 10^-7 +++ +++ +++ ++ ++ +++   418 10-⁶ +++ +++ +++ +++ ++ +++ газ 6 S. aureus-Wood-46 10^-1 Нет диффузного помутнения среды Нет диффузного помутнения среды Нет диффузного помутнения среды + слабое диффузное помутнение среды Нет диффузного помутнения среды Нет диффузного помутнения среды *+++ - отличный рост с диффузным помутнением среды; ++ - хороший рост с диффузным помутнением среды;

Таблица 3 Сравнительная характеристика биологического контроля бульона Мосселя на основе мясного пептона и смеси ПГРМ с мясным пептоном в соотношении 1:1, г/л № п/п Наименование тест-штамма Разведение Вариант 2 Вариант 2 Вариант 3 Вариант 3 Накопительный бульон для энтеробактерий по Мосселю (Бульон Мосселя) Merck   Пример 4 Пример 5 Пример 6 Пример 7 1 E. coli 25922 10^-7 +++ +++ +++ ++ +++     10^-6 +++ +++ +++ +++ +++ 2 E. coli 055:K59 10^-7 +++ +++ +++ ++ +++осадок   3912/41 10^-6 +++ +++ +++ +++ +++ 3 S. flexneri la 8516 10^-7 +++ +++ +++ +++ +++ 10^-6 +++ +++ +++ +++ +++ 4 S. typhimurium 79 10^-7 +++ +++ +++ +++ +++ 10^-6 +++ +++ +++ +++ +++ 5 K. pneumonia 10^-7 +++ +++ +++ +++ +++   418 10^-6 +++ +++ +++ +++ +++газ 6 S. aureus-Wood-46 10^-1 Нет диффузного помутнения среды Нет диффузного помутнения среды Нет диффузного помутнения среды Нет диффузного помутнения среды Нет диффузного помутнения среды *+++ - отличный рост с диффузным помутнением среды; ++ - хороший рост с диффузным помутнением среды;

Группа изобретений относится к биотехнологии. Варианты питательной среды для селективного накопления энтеробактерий содержат панкреатический гидролизат рыбной муки, либо пептон мясной, либо панкреатический гидролизат рыбной муки и пептон мясной (в соотношении 1:1), желчь очищенную модифицированную (ЖОМ), натрий хлористый, глюкозу, калий фосфорнокислый однозамещенный и бриллиантовый зеленый в заданном соотношении. Изобретения позволяют повысить эффективность накопления энтеробактерий, селективные свойства среды и упростить способ получения питательной среды. 3 н.п. ф-лы, 3 табл., 9 пр.

1. Питательная среда для селективного накопления энтеробактерий, сухая (Бульон Мосселя), содержащая белковую основу, глюкозу, калий фосфорнокислый однозамещенный и бриллиантовый зеленый, отличающаяся тем, что в качестве белковой основы содержит панкреатический гидролизат рыбной муки, дополнительно содержит желчь очищенную модифицированную (ЖОМ) и натрий хлористый при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:
панкреатический гидролизат   рыбной муки, сухой 8,0-12,0 глюкоза 4,0-6,0 натрий хлористый 2,0-2,8 желчь очищенная модифицированная 30,0-34,0 калий фосфорнокислый однозамещенный 0,4-0,6 бриллиантовый зеленый 0,01-0,02 pH готовый среды 7,2±0,2

2. Питательная среда для селективного накопления энтеробактерий, сухая (Бульон Мосселя), содержащая пептон мясной, глюкозу, калий фосфорнокислый однозамещенный и бриллиантовый зеленый, отличающаяся тем, что она содержит желчь очищенную модифицированную (ЖОМ) и натрий хлористый при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:
пептон мясной 8,0-12,0 глюкоза 4,0-6,0 натрий хлористый 2,0-2,8 желчь очищенная модифицированная 30,0-34,0 калий фосфорнокислый однозамещенный 0,4-0,6 бриллиантовый зеленый 0,01-0,02 pH готовый среды 7,2±0,2

3. Питательная среда для селективного накопления энтеробактерий, сухая (Бульон Мосселя), содержащая белковую основу, глюкозу, калий фосфорнокислый однозамещенный и бриллиантовый зеленый, отличающаяся тем, что в качестве белковой основы содержит панкреатический гидролизат рыбной муки и пептон мясной в соотношении 1:1, дополнительно содержит желчь очищенную модифицированную (ЖОМ) и натрий хлористый при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:
панкреатический гидролизат   рыбной муки сухой и пептон мясной 8,0-12,0 глюкоза 4,0-6,0 натрий хлористый 2,0-2,8 желчь очищенная модифицированная 30,0-34,0 калий фосфорнокислый однозамещенный 0,4-0,6 бриллиантовый зеленый 0,01-0,02 pH готовый среды 7,2±0,2