Изобретение относится к санитарной и клинической микробиологии и может быть использовано для селективного накопления энтеробактерий из воды, пищевых продуктов, клинического материала и т.д.
Ведущие зарубежные фирмы: Merck «Микробиология», 2004-2005 стр.202; HiMedia (HiMedia Laboratories Pvt. Limited (Индия), 1993, стр.80; и ООО «ГЕМ» «Среды бактериологические». Каталог 2009-2010, стр.48, выпускают накопительный бульон для энтеробактерий по Мосселю на основе панкреатического гидролизата желатина или пептона мясного. Компонентное содержание в г/л представлено в табл.1.
Для бактериологического контроля в соответствии с Государственной Фармакопеей Российской Федерации, XII издание, регламентирующей перечень питательных сред для селективного обогащения энтеробактерий, предусмотрен бульон Мосселя (Enterobacteria Enrichment Broth-Mossel) ОФС 42-0067-07.
Селективное накопление всех видов энтеробактерий в бульоне Мосселя обусловлено тем, что высокая концентрация бычьей желчи в совокупности с бриллиантовым зеленым подавляет рост сопутствующей микрофлоры, а глюкоза способствует росту энтеробактерий. Натриево-калийные фосфаты обеспечивают большую буферную емкость в среде, что защищает культуру от губительного действия образующейся кислоты.
До настоящего времени в России в связи с отсутствием отечественной коммерческой сухой питательной среды для селективного обогащения энтеробактерий в практике клинической и санитарной микробиологии используется бульон Мосселя лабораторного приготовления, а для контроля микробиологической чистоты лекарственных сред - среда №3 (среда обогащения для бактерий семейства Enterobacteriaceae).
Недостатками бульона Мосселя лабораторного изготовления в соответствии с рецептурой, представленной в ГФ, XII издание, и среды №3 являются:
- сложность приготовления;
- использование в качестве элективного фактора неочищенной желчи крупного рогатого скота - вещества химически неопределенного состава, затрудняющего получение объективных результатов;
- отсутствие отечественных сухих препаратов - пептона и желчи, обладающих высокой степенью прозрачности в растворах;
- необходимость фильтрации в случае использования основных компонентов среды отечественного производства, как дополнительный этап в процессе приготовления;
- слабая ингибирующая способность в отношении сопутствующих грамположительных микробов ассоциантов при обеспечении роста энтеробактерий;
- увеличение себестоимости среды в случае необходимости использования импортных препаратов.
Наиболее близким к предлагаемому бульону Мосселя является коммерческий бульон Мосселя (Merck), который состоит из следующих компонентов, г/л:
Недостатком коммерческой среды (Merck) является:
- недостаточная эффективность при росте и селективном накоплении ряда энтеробактерий;
- недостаточно выраженные ингибирующие свойства в отношении микробов-ассоциантов;
- ограниченная доступность.
Задачей изобретения является создание отечественной сухой питательной среды для селективного накопления энтеробактерий, обладающей большей эффективностью, с более высокими селективными свойствами, обеспечивающей доступность и получение объективных результатов бактериологического контроля.
Поставленная задача решается тем, что предлагается питательная среда для селективного накопления энтеробактерий, сухая, содержащая белковую основу, глюкозу, калий фосфорнокислый однозамещенный и бриллиантовый зеленый, причем в качестве белковой основы она содержит панкреатический гидролизат рыбной муки, либо пептон мясной, либо панкреатический гидролизат рыбной муки и пептон мясной (в соотношении 1:1), желчь очищенную модифицированную (ЖОМ) и натрий хлористый при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:
Вариант первый:
Вариант второй:
Вариант третий:
Технический результат достигается за счет предварительной подготовки сырой желчи. С этой целью нативную желчь КРС кипятят и фильтруют через фильтровальную ткань (бельтинг) в изоэлектрических точках, при каждом значении pH, с целью осаждения белков и высокомолекулярных пептидов. Заключительный этап подготовки желчи состоит из адсорбции примесей активным углем, внесения расчетного количества двузамещенного фосфата натрия в пересчете на содержание сухих веществ, кипячения и фильтрации. Это позволяет исключить дополнительное внесение фосфата натрия в состав среды, обеспечивая высокую буферную емкость готовой среды и ее прозрачность. Сбалансированность компонентного состава среды, включая панкреатический гидролизат рыбной муки (ПГРМ), в качестве белковой питательной основы, обеспечивает хорошие ростовые и селективные свойства бульона Мосселя.
Способ получения бульона Мосселя предусматривает смешивание сухих компонентов, г/л:
Панкреатический гидролизат рыбной муки или пептон мясной обеспечивают ростовые потребности микроорганизмов в азотистом питании. Предварительная подготовка желчи КРС позволяет получить сухую желчь очищенную модифицированную (ЖОМ), обеспечивающую высокую буферную емкость и прозрачность готовой питательной среды, ингибирующие свойства в отношении нежелательной сопутствующей бактериальной флоры и селективное накопление энтеробактерий, не угнетаемое в результате образования кислых продуктов жизнедеятельности.
Отличием предлагаемой среды от прототипа является возможность использования наряду с пептоном мясным панкреатического гидролизата рыбной муки в качестве белковой основы. Технология подготовки сырой желчи с использованием натрия фосфорнокислого двузамещенного исключает дополнительное внесение его в среду. Количественное соотношение компонентов питательной среды, ее pH, обеспечивают среде сохранение хороших ростовых свойств, эффективность накопления энтеробактерий и ингибирующий эффект в отношении сопутствующей микрофлоры. Готовая среда сохраняет стерильность не менее 10 суток
Для достижения технического результата на стадии производства желчи очищенной модифицированной (ЖОМ) желчь после осаждения белков в изоэлектрических точках, адсорбции примесей активным углем с внесением двузамещенного фосфата натрия из расчета 12,0 г на каждые 20,0 г желчи, в пересчете на сухое вещество, сушат на сушильной установке в виброкипящем слое А1-ФМУ.
Пример 1. Для приготовления среды по первому варианту берут навески следующих ингредиентов, г/л:
Навески размешивают в 1 л дистиллированной воды, разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют автоклавированием при температуре 121°C в течение 5 мин.
Предлагаемая среда, прозрачная, зеленого цвета, обеспечивает рост и накопление следующих тест-штаммов семейства Enterobacteriaceae при посеве по 0,5 мл микробной взвеси из разведения 10-7:
E. coli 25922
E. coli O55:K59 3912/41
S. flexneri 1a 8516
S. typhimurium 79
K. pneumonia 418
K. pneumonia 3534/51
Предлагаемая среда в значительной степени ингибирует рост грамположительных микроорганизмов, в частности S. aureus Wood-46, из разведения 10-1.
Используемые для контроля среды тест-штаммы микроорганизмов получены из отдела коллекционных культур ФБУН ГНЦ ПМБ.
Готовят стандартную взвесь культуры каждого тест-штамма, соответствующую 10 единицам по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85 П, с использованием стерильного 0,9% раствора натрия хлористого. Полученные взвеси культур десятикратными разведениями (4,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида с 0,5 мл микробной взвеси) доводят до разведения 10-7 (для S. aureus Wood-46 - до разведения 10-1) и используют для контроля среды.
Для определения ростовых свойств засев производят по 0,5 мл микробной взвеси каждого из тест-штаммов из разведения 10-7 в 5,0 мл бульона Мосселя, т.е. 10 м.к./мл среды. Посевы инкубировали при температуре (37±1)°C в течение 20-24 ч. Результаты биологического контроля лабораторных образцов бульона Мосселя на наборе тест-штаммов представлены в таблице 2.
Пример 2. Среду готовят в соответствии с примером 1.
Результаты биологического контроля представлены в таблице 2 и аналогичны результатам проверки по примеру 1.
Пример 3. Среду готовят в соответствии с примером 1.
Результаты биологического контроля представлены в таблице 2 и аналогичны результатам проверки по примеру 1.
Пример 4. Для приготовления бульона Мосселя в соответствии со вторым вариантом берут навески следующих ингредиентов, г/л:
Навески размешивают в 1 л дистиллированной воды, разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют автоклавированием при температуре 121°C в течение 5 мин.
Результаты биологического контроля представлены в таблице 3 и аналогичны результатам проверки примеров 1, 2, 3 по варианту 1.
Пример 5. Среду готовят в соответствии с примером 4.
Результаты биологического контроля представлены в таблице 3 и аналогичны результатам проверки примеров 1, 2, 3 по варианту 1.
Пример 6. Для приготовления бульона Мосселя в соответствии с третьим вариантом берут навески следующих ингредиентов, г/л:
Навески размешивают в 1 л дистиллированной воды, разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют автоклавированием при температуре 121°C в течение 5 мин.
Результаты биологического контроля бульона Мосселя в соответствии с вариантом 3 представлены в таблице 3 и аналогичны результатам проверки по примерам 1, 2, 3.
Пример 7. Среду готовят в соответствии с примером 6.
Результаты биологического контроля представлены в таблице 3 и аналогичны результатам проверки по примерам 1, 2, 3.
Пример 8. Среду готовят в соответствии с примером 1.
Результаты биологического контроля представлены в таблице 2.
Оценка качества предлагаемой среды для селективного накопления энтеробактерий с нарушением количественного соотношения ингредиентов:
Пример 9. Среду готовят в соответствии с примером 1.
Результаты биологического контроля представлены в таблице 2. Нарушение количественного соотношения ингредиентов среды в примерах 8, 9 ведет к ухудшению ростовых, ингибирующих свойств и, как следствие, снижению коэффициента эффективности накопления энтеробактерий.
Из таблиц сравнительных характеристик биологического контроля (табл.2, 3) видно, что предлагаемая питательная среда в соответствии с примерами 1-7 обладает хорошими ростовыми свойствами, эффективна в накоплении энтеробактерий и подавляет рост стафилококка.
Визуальный учет результатов накопления энтеробактерий по окончании срока инкубации посевов показал идентичные результаты в испытуемых и контрольной средах.
Изменение количественного соотношения компонентов среды ведет к нарушению биологических показателей качества предложенной среды.
Так, в случае приготовления среды в соответствии с примерами 8, 9 наблюдается снижение эффективности накопления энтеробактерий и ингибирующего эффекта среды в отношении S. aureus Wood-46.
Для получения данных по показателю эффективности бульона Мосселя засеянные пробирки каждого тест-штамма, содержащие около 10 м.к./мл - (нулевой посев) инкубировали при температуре (37±1)°C в течение 3 ч. Для определения посевной дозы 0,1 мл микробной взвеси каждого тест-штамма из разведения 10-7 высевали на чашки Петри с ГРМ агаром. После инкубации посевов в накопительной среде содержимое пробирок перемешивали и производили аналогичный высев на ГРМ агар.
Через 18-20 часов инкубации посевов на ГРМ агаре при температуре (37±1)°C производили подсчет сформировавшихся колоний. Показатель эффективности рассчитывали по приросту числа колоний после инкубации культуры в накопительной среде к числу колоний при нулевом посеве.
Сравнительная характеристика эффективности бульона Мосселя по варианту 1 представлена в таблице 3. Результаты эффективности накопления энтеробактерий бульона Мосселя, приготовленного в соответствии вариантами 2, и аналогичны и сопоставимы с результатами, полученными при испытании бульона Мосселя, вариант 1.
Таким образом, разработана отечественная конкурентоспособная сухая питательная среда для селективного обогащения энтеробактерий, имеющая ряд преимуществ:
эффективность накопления энтеробактерий в 1,5-2,0 раза выше, чем в коммерческой среде;
коэффициент ингибиции в отношении стафилококка более чем в 100 раз превышает показатель коммерческого накопительного бульона;
питательная среда проста в приготовлении;
разработана технология осветления желчи в изоэлектрических точках с использованием активного угля и двузамещенного фосфата натрия, исключающая дальнейшее внесение его в питательную среду, обеспечивающая прозрачность готового препарата;
исключена необходимость использования безводного натрия фосфорнокислого двузамещенного при изготовлении сухого препарата;
возможность использования панкреатического гидролизата рыбной муки наряду с пептоном мясным при сохранении ростовых и селективных свойств;
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КИШЕЧНОГО ИЕРСИНИОЗА И ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗА | 1995 |
|
RU2101342C1 |
Селективная питательная среда с маннитом, желчью и полимиксином для выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia сухая | 2022 |
|
RU2792438C1 |
СУХАЯ ХРОМОГЕННАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ КОЛИФОРМНЫХ БАКТЕРИЙ И E.coli (ВАРИАНТЫ) | 2012 |
|
RU2508400C1 |
Питательная среда для получения биомассы листерий | 2021 |
|
RU2767782C1 |
ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ НАКОПЛЕНИЯ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ | 2004 |
|
RU2267530C2 |
ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ШИГЕЛЛ И САЛЬМОНЕЛЛ | 2002 |
|
RU2233885C2 |
Питательная среда для выделения Pseudomonas aeruginosa | 2019 |
|
RU2709136C1 |
СЕЛЕКТИВНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ПСЕВДОМОНАД, СУХАЯ | 2013 |
|
RU2530549C1 |
Дифференциально-элективная питательная среда для выделения клебсиелл | 2019 |
|
RU2704854C1 |
ШТАММ БАКТЕРИЙ Pseudomonas panipatensis ВКПМ В-10593 - ДЕСТРУКТОР НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ | 2012 |
|
RU2484130C1 |
Группа изобретений относится к биотехнологии. Варианты питательной среды для селективного накопления энтеробактерий содержат панкреатический гидролизат рыбной муки, либо пептон мясной, либо панкреатический гидролизат рыбной муки и пептон мясной (в соотношении 1:1), желчь очищенную модифицированную (ЖОМ), натрий хлористый, глюкозу, калий фосфорнокислый однозамещенный и бриллиантовый зеленый в заданном соотношении. Изобретения позволяют повысить эффективность накопления энтеробактерий, селективные свойства среды и упростить способ получения питательной среды. 3 н.п. ф-лы, 3 табл., 9 пр.
1. Питательная среда для селективного накопления энтеробактерий, сухая (Бульон Мосселя), содержащая белковую основу, глюкозу, калий фосфорнокислый однозамещенный и бриллиантовый зеленый, отличающаяся тем, что в качестве белковой основы содержит панкреатический гидролизат рыбной муки, дополнительно содержит желчь очищенную модифицированную (ЖОМ) и натрий хлористый при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:
2. Питательная среда для селективного накопления энтеробактерий, сухая (Бульон Мосселя), содержащая пептон мясной, глюкозу, калий фосфорнокислый однозамещенный и бриллиантовый зеленый, отличающаяся тем, что она содержит желчь очищенную модифицированную (ЖОМ) и натрий хлористый при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:
3. Питательная среда для селективного накопления энтеробактерий, сухая (Бульон Мосселя), содержащая белковую основу, глюкозу, калий фосфорнокислый однозамещенный и бриллиантовый зеленый, отличающаяся тем, что в качестве белковой основы содержит панкреатический гидролизат рыбной муки и пептон мясной в соотношении 1:1, дополнительно содержит желчь очищенную модифицированную (ЖОМ) и натрий хлористый при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:
Устройство для усиления микрофонного тока с применением самоиндукции | 1920 |
|
SU42A1 |
Печь для непрерывного получения сернистого натрия | 1921 |
|
SU1A1 |
ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ НАКОПЛЕНИЯ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ | 2004 |
|
RU2267530C2 |
ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ШИГЕЛЛ И САЛЬМОНЕЛЛ | 2002 |
|
RU2233885C2 |
ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ПЕРВИЧНОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ | 2003 |
|
RU2268932C2 |
ПОЛЯК М.С | |||
и др., Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии, Санкт- Петербург, Элби-СПб, 2008, стр | |||
Парный автоматический сцепной прибор для железнодорожных вагонов | 0 |
|
SU78A1 |
Авторы
Даты
2015-06-10—Публикация
2013-06-04—Подача