СПОСОБ СЕЛЕКЦИИ ОДНОПЛАЗМИДНЫХ ВАРИАНТОВ BACILLUS ANTHRACIS В S-ФОРМЕ ИЗ СМЕШАННОЙ (S-R) ПОПУЛЯЦИИ С ПОМОЩЬЮ MYXOCOCCUS XANTHUS Российский патент 2004 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/07 C12Q1/04 C12R1/01 

Изобретение относится к микробиологии и экологии, в частности к способам селекции одноплазмидных вариантов в S-форме возбудителя сибирской язвы.

Сибирская язва - особо опасное инфекционное заболевание, которое протекает тяжело и скоротечно, нередко заканчивается летально, особенно при висцеральной (генерализованной) форме. Это сапрозоонозная инфекционная болезнь. Резервуаром возбудителя служит почва, где происходят основные фазы персистенции (переживания и размножения) бацилл. Основной причиной устойчивого неблагополучия по сибирской язве определенных мест и территорий является известное свойство микроорганизма образовывать споры, обладающие высокой жизнеспособностью и продолжительной сохраняемостью в окружающей среде.

На территории Российской Федерации, в странах ближнего и дальнего зарубежья находится значительное количество неблагополучных по сибирской язве регионов (1). В России ежегодно регистрируются случаи заболевания людей и животных сибирской язвой и, соответственно, выявляются очаги с различной эпидемической и эпизоотологической активностью (2). Особую актуальность возбудитель сибирской язвы приобрел после использования спор В. anthracis в качестве орудия биологического терроризма (3).

До настоящего времени не уделялось должного внимания изменчивости сибиреязвенного микроба, что затрудняло его индикацию и идентификацию. Особо остро этот вопрос стоял в контексте возможностей изменения генетических свойств В. anthracis в природных условиях.

Большинство исследователей, занимающихся изучением возбудителя сибирской язвы, первостепенное значение в проявлении патогенных свойств сибиреязвенного микроба придают экзотоксину и капсуле. К настоящему времени установлено, что утрата токсинообразования или капсулы приводит к резкому снижению вирулентности В. anthracis.

В 1983 г. Mikesell et al. (4) показали, что токсинообразование у В. anthracis детерминировано плазмидой рХО1 большой молекулярной массы, а в 1985 г. двумя группами исследователей Green et al (5) и Uchida et al.(6) обнаружена и охарактеризована плазмида рХ02 (рТЕ702), обуславливающая капсулообразование возбудителя сибирской язвы.

Экзотоксин В. anthracis обладает летальной, отечной и протективной активностями. Современные представления о механизмах действия сибиреязвенного токсина описаны многими исследователями, а наиболее полно представлены отечественными авторами в руководстве (7).

Другим фактором патогенности В. anthracis является капсула, которую обнаружил Serafini в 1888 г. С тех пор роль капсулы у этой бациллы в персистенции возбудителя в окружающей среде и ее причастность к патогенезу заболевания изучались многими исследователями. Наиболее полно охарактеризованы ранние фундаментальные исследования Preisz, Fischoder и др. в 1914 г. в обзоре отечественного ветеринарного врача М.В.Ревы (8).

Еще тогда сделано заключение, что капсула ингибирует фагоциты, защищает бациллы от бактерицидного действия гуморальных факторов макроорганизма, способствует фиксации бацилл на эукариотических клетках, вызывает резкое нарушение обменных процессов в клетках макроорганизма, быструю их деградацию и гибель.

В последние годы роль капсулы В.anthracis в вирулентности возбудителя уточнена; область ДНК, необходимая для осуществления инкапсуляции, клонирована и секвенирована (9). Идентифицированы три структурных гена сарА, сарВ и сарС, детерминирующие синтез соответствующих белков.

Капсульный антиген В.anthracis не обладает иммуногенными свойствами и рХ01^-, рХ02⁺ штаммы не защищают животных от заражения вирулентными рХ01⁺ pX02⁺ штаммами микроба. В то же время штаммы, утратившие плазмиду рХ02, т.е. pX01⁺, рХ02^-, сохраняют иммуногенность и могут использоваться в качестве живой аттенуированной вакцины.

Типичным и стабильным признаком вирулентных pX01⁺ pX02^- сибиреязвенных штаммов является способность образовывать капсулу на специальных питательных средах и в макроорганизме. Фенотипическое выражение капсулообразования у вирулентных штаммов in vitro происходит при культивировании в атмосфере СО₂ на средах, содержащих сыворотку или бикарбонат натрия. Авирулентные штаммы В.anthracis (pX01^-, рХ02⁺) могут формировать капсулу и на обычных (без сыворотки и бикарбоната) средах в аэробных условиях (10).

Фенотипическая экспрессия капсулы у штаммов В.anthracis, содержащих плазмиду рХ02, обусловливает S (гладкий) диссоциативный рост колоний на плотных питательных средах, а штаммы В. anthracis, не имеющие плазмиды рХ02 - (pX01⁺, pX02^- либо рХ01^-, рХ02^-), на плотных питательных средах растут в виде R (шероховатых) колоний.

В любой природной (из внешней среды) популяции клеток В. anthracis могут одновременно существовать четыре варианта (по плазмидному составу) данного микроорганизма (см. таблицу).

Многие микробиологи, занимающиеся генетикой возбудителя сибирской язвы или пытающиеся с помощью генно-инженерных методик получить вакцинные штаммы для профилактики сибирской язвы, вынуждены иметь набор всех четырех изогенных вариантов B.anthracis.

Вариант В. anthracis (pX01⁺, pX02⁺) обычно является исходным вирулентным штаммом. Селекция второго pX01⁺, pX02^- варианта из исходного не представляет особых затруднений. Для этого исходный штамм В. anthracis инкубируют в бульоне при непермиссивных (42°С) условиях в течение 7 -14 дней, высевают на сывороточную (бикарбонатную) среду и выращивают в анаэробных (СО₂) условиях. Отобранные R диссоциативные формы колоний после проверки их токсигенности составят изогенный набор клонов второго pX01⁺, pX02^- варианта В. anthracis. Таким способом были получены: вакцинный штамм 1190-R Stomatin в 1934 г.; 34 F₂ Sterne в 1937 г.; штаммы СТИ-1 и СТИ-3 Гинсбургом Н.Н. и Тамариным А.Л. в 1940 г. (7).

Наиболее трудоемкой является селекция третьего pX01^-, pX02⁺ варианта В.anthracis.

Показано (Fouet А., Моск. И., 1996), что присутствие плазмиды pX01 в клетках В. anthracis приводит к увеличению продукции капсульного вещества, тогда как плазмида pX02 не оказывает влияния на синтез токсических компонентов, но отобрать S колонии на сывороточной среде pX01^-, pX02⁺ вариант, отдифференцировав его от S клонов pX01⁺, pX02⁺ исходного вирулентного штамма по выражению капсулы, не представляется возможным.

Частота спонтанной элиминации таких крупных плазмид как pX01 и pX02 из клеток популяции В. anthracis в естественных условиях составляет 10^-5 – 10^-7 клеток. Частоту мутации (элиминации) у вегетативных клеток B.anthracis можно несколько увеличить, применив методы индукции физическим (t°C) или химическим (новобиоцин) факторами (5). Однако отбор S клонов рХ01^-, pX02⁺ вариантов, выращенных в аэробных условиях на обычной (Хоттингера) среде, хотя и возможен, но на практике очень затруднителен, поскольку необходимо проанализировать десятки - сотни тысяч колоний, чтобы селекционировать клон третьего варианта. Таким трудоемким способом выделен штамм B.anthracis Davies (рХ01^-, pX02⁺) (11) и значительно позже - B.anthracis KM34 из вирулентного штамма B.anthracis 81/1 (12). Эти методы являются прототипом предложенного нами способа селекции S-клонов рХ01^-, рХ02⁺ вариантов B.anthracis.

Возбудитель сибирской язвы, наряду со способностью образовывать споры, обладает и другими адаптационными механизмами, которые могут обеспечивать существование его в почве. Метаболический аппарат B.anthracis при попадании клетки в почву способен быстро включать резервные адаптационные системы, дающие микроорганизму возможность при определенных условиях осуществлять репродукцию и тем самым значительно увеличить численность микробной популяции (13, 14).

При изучении закономерностей биологических циклов развития возбудителя сибирской язвы в некоторых биогеоценозах показано: появление у "почвенных" штаммов диссоциативных форм (R-S); деструкция клеток B.anthracis - потеря их четких контуров; разрыхление клеточной стенки; зернистость протоплазмы (13, 14). Отмечено изменение антигенного состава, снижение вирулентности. Выявлено резкое увеличение протеолитической, лецитиназной и каталазной активностей, что, по-видимому, является адаптационной способностью B.anthracis.

Таким образом, B.anthracis имеет не только паразитическую фазу развития в организме животного или человека, но также сапрофитическую, персистируя в почве и на длительный период становясь сочленом почвенного биоценоза, т.е. сапрозоонозом (15).

Для доказательства сапрофитической природы возбудителя сибирской язвы возможно применение методологии экологического представления о стратегии отбора микроорганизмов. Под стратегией отбора по Роботнову Т.А. (16) необходимо понимать "совокупность приспособлений, обеспечивающих виду возможности обитать совместно с другими организмами и занимать определенное положение в соответствующих биоценозах".

Известно, что патогенные почвенные микроорганизмы (возбудители сапронозов) находятся в симбиотических взаимоотношениях с различными сапрофитами, к которым относится и представитель скользящих бактерий Myxococcus xanthus (17).

Этот убиквитарно распространенный микроорганизм подробно охарактеризован в кратком определителе бактерий Берги (18). М xanthus формирует популяцию, состоящую из клеток с различными физиологическими функциями. При этом миксобактерии никогда не существуют как отдельные клетки, а формируют многоклеточные образования в виде плодовых тел. Клетки популяции миксококков секретируют тяжи слизи - "струи", которые направляют движение совокупностей клеток (фиг.1).

Такая колония (плодовое тело) окружает клетки гетерологичных микроорганизмов и заключает их в своеобразные складки в виде "спирали Архимеда", называемые "карманами" (фиг.2).

В них происходит как питание миксококков продуктами метаболизма захваченных клеток, так и сохранение последних.

Миксобактерии чаще всего встречаются в почве; они растут на разлагающемся растительном материале - траве, листьях, коре живых деревьев или помете животных. Есть виды миксобактерий, обитающих в водной среде (18).

Применение методологии экологического понятия о стратегии отбора микроорганизмов (16) для решения центрального вопроса в учении о сапронозах относительно места возбудителей этих инфекций в почвенных биотах позволяет считать вполне возможным совместное обитание В.anthracis и M.xanthus как К-стратегистов.

Моделирование возможного сохранения и распространения В. anthracis в плодовых телах М. xanthus, а также разработка способов регистрации симбиотических взаимоотношений патогенных микроорганизмов с сапрофитами осуществлены нами ранее (19, 20).

Целью настоящего изобретения является разработка нового метода дифференциации S и R одноплазмидных вариантов В. anthracis на обычных питательных средах, на основе которого предлагается способ селекции одноплазмидных рХ01^-, pX02⁺ вариантов В. anthracis в S-форме из смешанной (S-R) популяции с помощью М. xanthus.

Для достижения поставленной цели на поверхности свежеразлитой плотной питательной среды агара Хоттингера (или агара Луриа) бактериологической петлей наносят штрихи бактериальной массы штаммов В.anthracis -а) СТИ(рХ01⁺, рХ02^-) и б) Davies (рХ01^-, pX02⁺), а также в) короткий штрих биомассы М. xanthus по схеме I (фиг.3).

Через 48-72 ч после подращивания посева на поверхности агара появился выраженный рост микроорганизмов в месте нанесения штрихов. При этом вокруг штриха а) штамма Davies (рХ01^-, рХ02⁺) плодовые тела М xanthus заполнены капсульными клетками B.anthracis в S форме, а бескапсульные клетки в штрихе б) штамма СТИ (рХ01⁺, pX02^-) поглощены плодовыми телами М. xanthus и, по-видимому, лизированы (II фиг.3).

Такой визуальный эффект, продемонстрированный на фиг.3, позволяет дифференцировать на обычных питательных средах S и R диссоциативные формы одноплазмидных вариантов В. anthracis с помощью M.xanthus.

Возможность дифференцировать S и R одноплазмидные варианты B.anthracis на обычных питательных средах положена нами в основу способа селекции одноплазмидных вариантов В.anthracis в S-форме из смешанной (S-R) популяции с помощью М. xanthus.

В отличие от аналогичного способа Green et al. (5) для селекции капсульных форм одноплазмидных вариантов В. anthracis мы не использовали антибиотик новобиоцин для повышения частоты элиминации плазмиды рХ01, а применили более естественное воздействие физического фактора (42,5°С) на популяцию двухплазмидных (pX01^-, pX02⁺) клеток B.anthracis, как в свое время Л.Пастер и Ценковский эмпирически применили для аттенуации вирулентного штамма возбудителя сибирской язвы (21) при получении вакцины.

Пример № 1

Для селекции капсульных форм одноплазмидных вариантов B.anthracis (рХ01^-, pX02⁺) из исходного вирулентного (двухплазмидного pX01^-, pX02⁺) варианта B.anthracis предварительно элиминировали плазмиду рХ01. С этой целью вирулентный штамм B.anthracis 81/1 посеяли в 5 мл бульона и культивировали его при 42,5°С в течение двух недель. Затем произвели посев штрихами на поверхность агара Хоттингера - а) исходного штамма B.anthracis 81/1 и б) изогенного варианта после температурной обработки, а также в) М. xanthus по схеме, обозначенной на фиг.3. После подращивания посевов на плотной питательной среде в течение 72 ч получили результат, зафиксированный на фиг.4-I.

В результате получена картина роста В. anthracis и М. xanthus (фиг.4-1), подобная продемонстрированной на фиг.3 и отличающаяся только количеством плодовых тел М xanthus, поглотивших инкапсулированные клетки B.anthracis.

Такое отличие можно объяснить только составом популяции штамма В. anthracis Davies, 100% клеток которого являются рХ01^-, pX02⁺, а популяция штамма В. anthracis 81/1 после температурной обработки имеет часть клеток с такой же характеристикой.

Для уточнения характеристики роста S-клонов В. athracis, находящихся в плодовых телах М. xanthus, биомасса плодового тела с включениями снята с помощью бактериологической петли с поверхности агара и повторно пересеяна на поверхность плотной питательной среды (фиг.4-11). Контролем служил посев (штрих а) исходного варианта В. anthracis (pX01⁺ pX02⁺). Полученная картина роста (фиг.4-11) резко отличается от фиг.4-1 большим количеством плодовых тел М xanthus, заполненных клонами В.anthracis в S-форме.

Пример 2

Селекция капсульных форм одноплазмидных вариантов В.anthracis (рХ01^-, pX02⁺) возможна и из смешанной популяции вакцинного штамма В.anthracis Ценковский II, которая состоит: из клонов варианта pX01⁺, pX02⁺; клонов рХ01⁺, рХ02^- и небольшого количества клонов рХ01^-, pX02⁺, что подтверждается (фиг.5) при использовании способа дифференциации S и R вариантов, продемонстрированного на фиг. 3.

Таким образом, преимущества предлагаемого способа селекции капсульных S-форм одноплазмидных вариантов В.anthracis (рХ01^-, pX02⁺), необходимого при создании банка (набора) генетически измененных вариантов возбудителя сибирской язвы, по сравнению с селекционными методами прототипа (12) и аналога (5), заключаются в следующем:

1. Предлагаемый способ более прост, не требует специальных сред с добавлением сыворотки или бикарбоната натрия и условий культивирования в атмосфере.

2. Отбор (селекция) инкапсулированных клонов В.anthracis (pX01^-, pX02⁺) осуществляется в плодовых телах клеток М.xanthus.

3. Разработанный способ селекции одноплазмидных вариантов В. anthracis в S-форме может быть полезным для конструирования и изучения штаммов сибиреязвенного микроба, обладающих различным набором собственных плазмид, что, в свою очередь, может служить для изучения экологических систем с определением экологической валентности компонентов, что важно для разрешения эпидемиологических проблем.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Микробиологическая диагностика сибирской язвы /Маринин Л.И., Онищенко Г.Г., Степанов А.В. и др. - М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999. – 224 с.

2. Черкасский Б.Л. Закономерности территориального распространения и проявления активности стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 1999. - №2. - С. 48-52.

3. Inglesby Т., O'Toole Т., Henderson D. et al. Anthrax as a biological weapon //JAMA. - 2002. - V.287. - P. 2236-2252.

4. Mikesell P., Ivins B.E., Ristroph V.D., Dreier T.M. Evidence for plasmid-mediated toxin production in Bacillus anthracis // Infect. Immun. - 1983. - V.39, №1. - P. 371-376.

5. Green B.D., Battisti L., Kochler T.M., Thorne C.B., Ivins B.E. Demonstration of a capsule plasmid in Bacillus anthracis // Infect. Immun. - 1985. - V.49, №2. - P. 291-297.

6. Uchida J., Sekizaki Т., Hashimoto K., Terakado N. Association of the encapsulation of Bacillus anthracis with a 60 megadalton plasmid // J. Gen. Micro-biol. - 1985. - V.131, №2. – 3663.

7. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики/Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов Н.В. и др. - М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999. - С. 52-66.

8. Рева М.В. К вопросу об образовании сибиреязвенными бациллами капсул на искусственных питательных средах // Вест. общ. вет. - 1914. - С. 1161-1172.

9. Makino S. - J., Sasakawa Ch., Uchida N. et al. Cloning and CO₂-dependent expression of the genetic region for encapsulation from Bacillus anthracis // Mol.Microbiol. - 1988. - V.2, №3. - P. 371-376.

10. Thorne C.B. Biochemical properties of virulent and avirulent strains of Bacillus anthracis // Ann.N.Y.Acad.Sci. - 1960. - V.88. - P. 1024-1033.

11. Davies D.Y., Harvey B.W.S. The isolation of Bacillus anthracis from bones // Lancet. - 1955. - V.269, №2. - Р. 86-87.

12. Конструирование и изучение штаммов сибиреязвенного микроба, обладающих различным набором собственных плазмид/Еремин С.А., Ежов И.Н., Костюкова Т.А. и др. // Молекул. генет., Микробиол. и вирусол. - 1989. - №10. - С. 35-38.

13. Родзиковский А.В. Популяционная динамика сибиреязвенного микроба в некоторых почвах. Дис. канд. мед. наук. - Иркутск, 1989, - 114 с.

14. Изучение закономерностей биологических циклов развития микроба сибирской язвы в некоторых биогеоценозах Восточной Сибири и Дальнего Востока: Отчет о НИР (заключительный). Науч. руководитель Ю.И. Соркин. / Иркутский НИПЧИ. - Иркутск. - 1990. – 59 с.

15. Литвин В.Ю. Общие закономерности и механизмы существования патогенных микроорганизмов в почвенных и водных экосистемах//Экология возбудителей сапронозов. - М., 1988. - С. 20-34.

16. Работнов Т.А. // Бюл. МОИН. Отд. биол. - 1975. - №30, №2. - С. 5-11.

17. Dworkin M. Recent advances in the social and developmental biology of the Mycobacteria // Microbiol. Rev. - 1996. - V.60, №1. - P. 70-102.

18. Хоут Дж. Краткий определитель Берги. Скользящие бактерии. - М.: Изд-во"Мир", 1980. - С. 49-53.

19. Буланцев А.Л., Липницкий А.В. Моделирование возможного сохранения и распространения Bacillus anthracis во внешней среде //Матер, юбил. конф., посвящ. 70-летию НИИ микробиологии МО РФ. - Киров, 1998. - С. 356-357.

20. Буланцев А.П., Липницкий А.В. Разработка способов регистрации симбиотических взаимоотношений патогенных микроорганизмов с сапрофитами // Природно-очаговые ООИ, их профилактика и лабораторная диагностика. - Астрахань, 2001. - С. 226-228.

21. Pasteur L. De L'atenuation des virus et de leur retour a la virulence // C. Rend. Acad.Sci. - 1881. - V.92. - P. 429-435.

Изобретение относится к микробиологии и экологии, в частности к способам селекции одноплазмидных вариантов возбудителя сибирской язвы в S-форме. Для осуществления способа на поверхность плотной питательной среды засевают штрихами исходный штамм B.anthracis, содержащий S и R диссоциативные формы клеток возбудителя сибирской язвы, и штамм M.xanthus для их совместного роста. После подращивания посева при 37°С в течение 72 ч на поверхности агара вокруг разросшегося штриха B.anthracis появляется рост M.xanthus в виде струй с плодовыми телами, содержащими инкапсулированные клетки B.anthracis, которые отбирают бактериологической петлей. Биомассу отобранных плодовых тел M.xanthus, содержащих клоны B.anthracis в S-форме, засевают в питательный бульон и культивируют при 37°С в течение 18-24 ч. Затем из бульона делают рассев штрихам на поверхности плотной питательной среды для образования единичных колоний B.anthracis в S-форме. Использование способа позволяет конструировать и изучать штаммы сибиреязвенного микроба, обладающие различным набором собственных плазмид, что, в свою очередь, позволяет изучать экологические системы с определением экологической валентности компонентов, что важно для разрешения эпидемиологических проблем. 1 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл.

1. Способ селекции одноплазмидных вариантов Bacillus anthracis в S-форме из смешанной (S-R) популяции с помощью Myxococcus xanthus, включающий посев на плотную питательную среду исходного (S-R) штамма В.anthracis, содержащего капсулированные (S) по отношению к бескапсульным (R) клонам 10^-5-10^-7 клеток, затем визуальный отбор S диссоциативных форм, отличающийся тем, что на поверхности плотной питательной среды сеют штрихами исходный (S-R) штамм В.anthracis и штамм М.xanthus для их совместного роста, после подращивания посева в термостате при 37°С в течение 72 ч на поверхности агара вокруг разросшегося штриха В.anthracis отмечается рост М.xanthus в виде "струй" с плодовыми телами, содержащими инкапсулированные клетки В.anthracis, которые отбирают бактериологической петлей.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что биомассу отобранных плодовых тел М.xanthus, содержащих клоны В.anthracis в S-форме, засевают в питательный бульон и культивируют в термостате при 37°С в течение 18-24 ч и затем из бульона делают рассев штрихами на поверхности плотной питательной среды для образования единичных колоний В.anthracis в S-форме.