СРЕДСТВО ГЕМОРЕОЛОГИЧЕСКОЕ, СНИЖАЮЩЕЕ ИНСУЛИНОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ И ВОССТАНАВЛИВАЮЩЕЕ ТОЛЕРАНТНОСТЬ ОРГАНИЗМА К ГЛЮКОЗЕ, И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ Российский патент 2010 года по МПК C07D487/04 A61K31/4188 A61P3/10 A61P7/02 

Изобретение относится к фармакологии, а именно к биологически активным веществам и композициям, обладающим одновременно гемореологическими свойствами и свойствами снижать инсулинорезистентность и восстанавливать толерантность организма к глюкозе, которые могут быть использованы при создании препаратов, снижающих инсулинорезистентность и подавляющих агрегацию эритроцитов. Данное сочетание двух видов активности чрезвычайно важно, так как при сахарном диабете на ранних стадиях развития отмечается нарушение микроциркуляции, проявление синдрома повышенной вязкости крови и развития сладж синдрома (Дедов И.И., Фадеев В.В. Введение в диабетологию. - М., 1998. - 199 с.).

Известно, что при сахарном диабете 2 типа ведущим механизмом развития заболевания является снижение чувствительности организма к инсулину - синдром инсулинорезистентности (Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. Лечение сахарного диабета и его осложнений. Руководство для врачей. - М.: Медицина, 2005, с.18-21). При этом происходит существенное изменение тромбогенного потенциала крови и ее гемореологических свойств. Так повышается способность тромбоцитов к агрегации, что и определяет высокую способность к тромбообразованию (повышается тромбогенный потенциал крови). Кроме того, повышается способность эритроцитов к агрегации с развитием сладж синдрома, в конечном итоге проявляющегося увеличением вязкости крови и нарушением микроциркуляции (Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. Лечение сахарного диабета и его осложнений. Руководство для врачей. - М.: Медицина, 2005, с.283).

Существует ряд синтетических гипогликемических препаратов, снижающих инсулинорезистентность, восстанавливающих толерантность организма к углеводам и предназначенных для лечения сахарного диабета при пероральном применении. Все эти препараты делятся на две основные группы: бигуаниды и производные сульфонилмочевины.

Наиболее близким по выполнению и достигаемому результату является диабетон (гликлазид) 1-(3-азабицикло[3,3,0]октил-3)-3-(пара-толилсульфонил) мочевина (М.Д. Машковский. - Лекарственные средства. - 15-е изд., перераб., исп.и доп.- М.: Новая волна, 2006. - С.561.), разработанный фирмой «Сервье» (Франция). Действие его связано главным образом с восстановлением физиологического профиля продукции инсулина, снижением инсулинорезистентности и снижением агрегации тромбоцитов. Этот препарат уже длительное время используется при сахарном диабете 2 типа не только для сахароснижающего эффекта, но и для стабилизации тромбогенного потенциала крови и гемореологии. Так гликлазид снижает способность тромбоцитов к агрегации, нормализует нарушенный фибринолитический потенциал сосудистой стенки и процесс фибринолиза, замедленный при сахарном диабете. Гликлазид как сахароснижающее средство начинает действовать через 1 час после приема, максимум эффекта наблюдается между 4-м и 8-м часом, продолжительность действия немного меньше 20 часов. Ангиопротективное влияние проявляется лишь после 3-х месяцев лечения и еще более отчетливо через 6-12 месяцев.

Таким образом, применяемые в настоящее время в клинической практике гипогликемические препараты, сочетающие сахароснижающий эффект с микроваскулярным действием, не являются совершенными, так как у некоторых из них ангиопротективное влияние проявляется только после 3-12 месяцев после начала приема (гликлазид) (Балаболкин М.Н., Клебанова Е.М., Креминская В.М. - Лечение сахарного диабета и его осложнений. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - С.167-177). Поэтому потребность в препаратах, сочетающих сахароснижающий эффект с ангиопротективным действием, но более эффективных, чем уже применяемые в клинической практике, весьма велика, и создание лекарственных средств с подобным оригинальным механизмом действия является актуальным.

Техническим результатом изобретения является повышение эффективности гемореологического действия (способности снижать повышенную вязкость крови и агрегацию эритроцитов), а также проявление свойства снижения инсулинорезистентности и восстановления толерантности организма к глюкозе при сахарном диабете, преддиабете, синдроме инсулинорезистентности и ожирении.

Технический результат достигается дигидрохлоридом 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а]бензимидазола (I):

Дигидрохлорид 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а]бензимидазола известен как соединение, обладающее гипогликемической (сахаропонижающей) и антиагрегантной активностью (способностью к снижению тромбогенного потенциала крови, т.е. снижению вероятности образования тромбов в кровеносном русле) (Anisimova V.A., Levchenko M.V., Korochina T.B., Spasov A.A., Kovalev S.G., Dudchenko G.P. Fr.Pat. 2691462 (1995), Bull., 95/23; EP 0571253. Ковалев Г.В., Спасов A.A., Анисимова В.А., Вдовина Г.П., Ковалев С.Г., Балаболкин М.И., Мамаева Г.Г., Дудченко Г.П., Левченко М.В. Пат. РФ №206148 (1996); бюл. №20). У соединения выявлена дополнительно гемореологическая активность (способность снижать повышенную вязкость крови, агрегацию эритроцитов и в конечном итоге приводить к восстановлению микроциркуляции), а также активность, снижающая инсулинорезистентность и восстанавливающая толерантность организма к глюкозе при сахарном диабете, преддиабете, синдроме инсулинорезистентности и ожирении.

Технический результат достигается также фармацевтической композицией при следующем соотношении ингредиентов, вес.%:

дигидрохлорид 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а]бензимидазола 20-92 крахмал и/или поливинилпирролидон М.м 7800-35000 (ПВП),   и/или натрий карбоксиметилцеллюлоза (NаКМЦ)   или оксипропилметилцеллюлоза (ОПМЦ) 7-40 кальция и/или магния стеараты 0,3-1,0 микрокристаллическая целлюлоза (мкц) и/или лактоза остальное (до 100)

Крахмал и/или поливинилпирролидон, NаКМЦ, ОПМЦ, мкц, лактозу использовали в качестве наполнителя и связывающего компонента гранул, кальция и/или магния стеарат - в качестве смазывающего антифрикционного компонента (Чуешев В.И., Чернов Н.Е., Хохлова Л.Н. и др. Промышленная технология лекарств, Харьков, Издательство НФАУ МКТ-книга, 2002, т.2, с.330-334). В то же время поливинилпирролидон, NaKМЦ, ОПМЦ и микрокристаллическая целлюлоза использовалась для пролонгирования действия субстанции (Чуешев В.И., Чернов Н.Е., Хохлова Л.Н. и др. Промышленная технология лекарств, Харьков, Издательство НФАУ МКТ-книга, 2002, т.2, с.352-355).

Фармацевтическую композицию получают следующим образом: для этого активное вещество дигидрохлорид 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а]бензимидазола смешивают с рассчитанным количеством лактозы до получения однородной массы, затем увлажняют водным раствором связующего вещества: крахмала, и/или ПВП, и/или (NAKMЦ), и/или ОПМЦ, гранулируют, получая гранулы до 2 мм, сушат при температуре не более 100 градусов, гранулируют, получая гранулы не более 1 мм. Полученные гранулы опудривают антифрикционными веществами: кальция и/или магния стеаратами и мкц. Полученную смесь помещают в твердые желатиновые капсулы с крышечкой или прессуют таблетки массой от 0,1-0,5 г.

Способ получения соединения I заключается в конденсации 2-амино-1-диэтиламиноэтилбензимидазола II с избытком дибромэтана, выделении из образующегося в результате реакции дигидробромида 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а]бензимидазола III основания Io действием щелочного агента и последующем переводе последнего в дигидрохлорид I обычными приемами, например действием раствора HCl.

Ниже приведен пример получения соединения I.

Пример 1. Дигидрохлорид 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а] бензимидазола (I).

Перемешиваемую суспензию 69,6 г (0,3 моль) 2-амино-1-диэтиламиноэтилбензимидазола (II) в 104 мл (1,2 моль) дибромэтана нагревают 30 мин при 140-145°С. Добавляют 80 мл ДМФА и нагревают смесь еще 10-15 мин. Охлаждают до 20-25°С, осадок отфильтровывают, промывают ДМФА и ацетоном, получая 106 г дигидробромида III (84%). Последний растворяют в 230 мл воды и подщелачивают 40%-ным раствором едкого натра до рН 10. Выделяющееся на поверхности светло-желтое масло (основание Tо) экстрагируют толуолом. Толуольную вытяжку промывают водой и сушат. Толуольный раствор подкисляют добавлением насыщенного раствора хлористого водорода в 2-пропаноле до рН 1. Выделившийся тяжелый бесцветный осадок дигидрохлорида I через 4-5 ч отфильтровывают, промывают ацетоном и высушивают при 100-110°С до постоянного веса. Выход 75 г (90,9%, считая на дигидробромид III, и 75%, считая на исходный амин II). Очищают технический «диабенол» до фармакопейной чистоты перекристаллизацией из 2-пропанола. Т.пл. 258-259°С. Найдено, %: С 54,4; Н 7,2; Cl 21,2; N 16,8. C₁₅H₂₂N₄·2HCl. Вычислено, %: С 54,4; Н 7,3; Cl 21,4; N 16,9. УФ-спектр (0,0025%-ный раствор дигидрохлорида I в 95%-ном EtOH), λ_max, нм: 217±2, 279±2 и плечо при (282-286)±2. ИК-спектр (ваз. масло) соединения I, см^-1: 1665 (C=N). Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), внутренний стандарт - ГМДС, м.д.: 1,29 (6Н, т, 2СН₃), 3,35 (4Н, к, 2СН₂), 3,69 (2Н, т, CH₂N), 4,41 (4Н, с, внутрицикл. (СН₂)₂), 4,62 (2Н, т, NCH₂), 7,41 (4Н, м, аромат. Н).

Реакцию с дибромэтаном можно проводить и в других растворителях, например ксилол, диоксан, диэтиленгликоль, диэтоксиэтан, бензонитрил, пропиленкарбонат, диметилсульфоксид, диметилформамид, однако лучшие результаты все же получены при проведении реакции в избытке дибромэтана.

Ниже приведены примеры получения композиции.

Пример 2. Дигидрохлорид 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а] бензимидазола (0,1 г) увлажняют 0,02 г NAKMЦ в виде раствора, гранулируют, сушат, гранулируют и просеивают через сито с диаметром отверстий не более 1 мм. Полученную массу опудривают 0,001 г кальция стеарата с размером частиц не более 0,16 мм и прессуют таблетки на таблеточном прессе.

Пример 3. Дигидрохлорид 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а]бензимидазола (0,15 г) увлажняют 0,04 г ОПМЦ в виде раствора, гранулируют, сушат, гранулируют и просеивают через сито с диаметром отверстий не более 1 мм. Полученную массу опудривают 0,007 г кальция стеарата с размером частиц не более 0,16 мм и прессуют таблетки на таблеточном прессе.

Пример 4. Дигидрохлорид 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а]-бензимидазола (0,1 г) смешивают с 0,355 г лактозы, увлажняют 0,04 г ПВП в виде раствора, гранулируют, сушат, гранулируют и просеивают через сито с диаметром отверстий не более 1 мм. Полученную массу опудривают 0,005 г кальция стеарата с размером частиц не более 0,16 мм и прессуют таблетки на таблеточном прессе.

Пример 5. Дигидрохлорид 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а]-бензимидазола (0,1 г) увлажняют 0,07 г крахмала в виде клейстера, гранулируют, сушат, гранулируют и просеивают через сито с диаметром отверстий не более 2 мм. Полученную массу опудривают 0,004 г магния стеаратом с размером частиц не более 0,16 мм и прессуют таблетки на таблеточном прессе.

Пример 6. Дигидрохлорид 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а]-бензимидазола (0,15 г) увлажняют 0,06 г ОПМЦ в виде раствора, гранулируют, сушат, гранулируют и просеивают через сито с диаметром отверстий не более 1 мм. Полученную массу опудривают 0,004 г магния стеарата с размером частиц не более 0,16 мм, фасуют и упаковывают в желатиновые капсулы с крышечкой.

Пример 7. Дигидрохлорид 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а]-бензимидазола (0,1 г) увлажняют 0,009 г ПВП в виде раствора, гранулируют, сушат, гранулируют и просеивают через сито с диаметром отверстий не более 1 мм, смешивают с 0,09 г мкц до получения однородной смеси. Полученную массу опудривают 0,0017 г магния стеарата с размером частиц не более 0,16 мм, фасуют и упаковывают в желатиновые капсулы с крышечкой. Все полученные таблетки и капсулы дигидрохлорида 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо-[1,2-а]бензимидазола удовлетворяют требованиям ГФ XI издания. Эти данные представлены в табл.1.

Таблица 1 Показатели качества гранулятов, таблеток и капсул препарата на основе дигидрохлорида 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а]бензимидазола, приготовленных с различными вспомогательными веществами Состав Сыпучесть, г/с Сила выталкивания, Н Механическая прочность Распадаемость, с сжатие, Н истирание, % 2 6,25±0,23 130 76,82±1,56 99,1±0,4 294±19 3 5,63±0,17 288 82,57±1,92 99,3±0,7 210±18 4 5,41±0,15 171 62,93±1,97 98,7±0,5 222±29 5 6,20±0,34 190 82,57±2,72 99,1±0,6 480±11 6 6,39±0,35 - - - 666±7 7 5,87±0,19 -     597±18

Предлагаемое соотношение действующих и вспомогательных веществ является оптимальным, обеспечивает получение качественных таблетированных и капсулированных лекарственных препаратов соединения I и достижение необходимого терапевтического эффекта.

Изучение биодоступности фармацевтической композиции

Исследование биодоступности фармацевтической композиции - в соответствии с «Методическими рекомендациями по доклиническому изучению фармакокинетики лекарственных средств» (Фирсов А.А. Методические указания по проведению доклинических исследований фармакокинетики фармакологических веществ и лекарственных средств / А.А.Фирсов, В.П.Жердев и др. // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ: под общ. ред. Р.У.Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - С.217-229).

Эксперименты по изучению фармакокинетики субстанции препарата I и ее фармацевтической композиции с ПВП были выполнены на 100 белых беспородных крысах-самцах массой 160-200 г. Субстанцию и композицию вводили зондом внутрижелудочно в дозе 25 мг/кг (из расчета на субстанцию). Взятие проб крови проводили через 0,5; 1; 2; 3 и 5 часов и мочи через 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 25, 36,48, 60 и 72 часа после введения изучаемого соединения или композиции. Сбор мочи осуществляли в метаболических камерах «Termoplast» (Италия). Кровь стабилизировали 5% раствором цитрата натрия.

Содержание соединения I определяли методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе «HEWLETT PACKARD» (США) серии 1050 с колонкой той же фирмы размером 100×2,1 мм, с сорбентом Hypersil MOS 5 мкм, при помощи элюента, содержащего 30% ацетатного буфера с рН 5.0 и 70% ацетонитрила, со скоростью потока 1 мл/мин, давлением 135 bar и чувствительностью 0,01 AU. Детектирование проводили на УФ-детекторе при длине волны 280 nm. При этих условиях время удержания препарата I - 5 минут. Чувствительность 100 нг/мл. Извлечение данного препарата проводили из цельной крови при экстракции ацетонитрилом в соотношении 1:1. Пробы центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин. Концентрацию препарата I определяли с помощью калибровочного графика.

Фармакокинетические параметры рассчитывали методом статистических моментов (Пиотровский В.К. Метод статистических моментов и интегральные модельно независимые параметры фармакокинетики. - Фармакология и токсикология. - 1986. - №5. - т.49. - с.118-127).

Фармакокинетическая кривая (фиг.1) при изучении композиции имеет аналогичный вид по сравнению с кинетикой кривой при введении субстанции соединения I с той лишь разницей, что снижение концентрации происходит не к 3-му, а к 5-му часу. Следует отметить, что при введении субстанции соединения I несколько быстрее достигается максимальная концентрация в крови.

Таким образом, при введении композиции наблюдается увеличение циркуляции соединения I в крови крыс, сопровождающееся увеличением периода полувыведения, временем пребывания молекулы соединения I в организме (MRT) и снижением общего клиренса на 21,4%. Фармакокинетические параметры субстанции I и композиции препарата представлены в табл.2. Относительная биодоступность композиции по отношению к раствору субстанции составляет 127,02%.

Таким образом, можно сделать вывод о биоэквивалентности композиции препарата по отношению к субстанции соединения I и пролонгации терапевтического эффекта этого соединения, связанной с уменьшением клиренса и увеличением периода его полувыведения.

Таблица 2 Фармакокинетические параметры субстанции соединения и композиции (при пероральном введении в дозе 25 мг/кг)   AUC, (мкг/мл) час , час Kel, час^-1 Cl, мл/час MRT, час Субстанция соединения I 10,29 1,58 0,44 2,43 2,33 Композиция 13,07 1,63 0,42 1,91 3,03

При исследовании экскреции соединения I через почки (фиг.2) было отмечено повышение его концентрации в моче со 2-го по 5-й час до максимума, а затем снижение концентрации к 12-му часу после введения субстанции I и к 24-му часу после введения композиции.

При исследовании экскреции соединения с мочой оценивали почечный клиренс (Cl_R), определяемый отношением кумулятивной экскреции препарата I с мочой к AUC препарата в крови.

Установлено, что почечный клиренс композиции препарата I был ниже данного показателя субстанции I на 26,9% (Cl_{R субст.}=2,91 мл/час, Cl_{R лек. формы.}=2,91 мл/час).

Таким образом, и по скорости выведения соединения с мочой можно сделать вывод о пролонгации его содержания в организме (при введении в виде композиции) вследствие уменьшения интенсивности выведения через почки.

Фармакологические свойства заявленного соединения

Данное соединение (I) снижает инсулинорезистентность и, тем самым, восстанавливает толерантность организма к глюкозе, подавляет агрегацию эритроцитов и, тем самым, снижает вязкость крови.

1. Влияние соединения на инсулинорезистентность определяли по изменению толерантности животных к глюкозе (пероральная глюкозная нагрузка) (Функциональные методы исследования в эндокринологии / З.И.Цюхно [и др.]. - Киев: Здоровье, 1981. - 240 с.) при:

- латентной форме стрептозотоцинового диабета (преддиабет);

- экспериментальном ожирении;

- экзогенной гиперинсулинемии (инсулинорезистентность)

и по взаимодействию с экзогенным инсулином на собаках с удаленной поджелудочной железой.

2. Влияние соединения на гемореологические свойства крови изучались в опытах при стрептозотоциновом диабете:

- по изменению вязкости крови;

- по подавлению агрегации эритроцитов, вызванной алциановым голубым.

Влияние соединения I на толерантность к глюкозе при латентной форме стрептозотоцинового диабета (преддиабет)

Действие соединения I на содержание глюкозы в крови животных с синдромом измененной толерантности к глюкозе исследовали на животных с латентной формой стрептозотоцинового диабета. Латентную форму стрептозотоцинового диабета воспроизводили по Колесник Ю.М. (Колесник Ю.М. Состояние островкового аппарата поджелудочной железы при экспериментальном сахарном диабете. - Архив патологии. - 1992. - T.54. - 12. - c.24-27) на белых беспородных крысах массой 160-220 г при внутрибрюшинном введении свежеприготовленного на цитратном буфере стрептозотоцина (Sigma) в дозе 30 мг/кг. Не ранее чем через три дня проводили отбор животных с нарушенной толерантностью к глюкозе. Пероральный глюкозотолерантный тест проводили по утрам после ночного (в течение 10-14 ч) голодания животных при интрагастральном введении раствора глюкозы в дозе 3 г/кг. Содержание глюкозы в крови крыс определяли глюкозооксидазным методом, используя наборы Био-Ла-Тест (Чехия, Лахема диагностика). При изучении антигипергликемических эффектов на модели нарушенной толерантности к углеводам у животных с латентной формой стрептозотоцинового диабета предполагалось уточнить влияние вещества на динамику секреции гормона (инсулин). Изучаемое соединение I и препарат сравнения с комбинированным механизмом действия - гликлазид (с выраженным панкреотропным действием) животные получали внутрижелудочно за 2 часа до начала эксперимента в дозах 25 и 50 мг/кг соответственно. По истечении данного времени им перорально вводили раствор глюкозы (3 г/кг) и в течение последующих 2 часов наблюдали за динамикой изменений глюкозы в крови. Для более объективной оценки изменения показателей глюкозной нагрузки считали показатели площади под кривой динамики изменения глюкозы в крови по А.В.Древаль (2005) (Древаль А.В. Анализ результатов перорального нагрузочного теста глюкозой с помощью простой математической модели / А.В.Древаль // Лаб. дело. - 1985. - №12. - С.737-741).

Активность соединений оценивали, принимая во внимание их гипогликемическую активность у животных с латентной формой стрептозотоцинового диабета и фиксируя антигипергликемический эффект исследуемых веществ у этих же животных после пероральной нагрузки глюкозой. Результаты исследования представлены на фиг.1 и в табл.3. Исходное содержание глюкозы у крыс, получавших различные исследуемые вещества, колебалось в пределах от 4,43±0,28 до 5,50±0,29 ммоль/л.

Однако следует отметить, что все животные, которые были взяты в эксперимент, прошли предварительную индивидуальную диагностику (пероральный нагрузочный тест глюкозой). По результатам ее в исследовании были использованы только крысы с нарушенной толерантностью к углеводам. Через два часа после начала эксперимента у животных всех групп, в том числе и контрольных, наблюдалось снижение глюкозы, однако у контрольных крыс эти изменения были статистически не значимы. Вещество I, подобно препарату сравнения гликлазиду, оказывало статистически значимое (Р<0,05) гипогликемическое действие. На фоне экзогенной гипергликемии в группе животных, получавших гликлазид и соединение I, было отмечено достоверное по абсолютным значениям, по сравнению с контрольными животными, снижение уровня глюкозы. Следует отметить, что уменьшение прироста глюкозы в крови в процентах относительно начала проведения глюкозотолерантного теста было зафиксировано у животных, которым вводили гликлазид только через час после углеводной нагрузки. В течение первых 30 минут процентный прирост глюкозы у животных этой группы не отличался от контрольных крыс, получавших растворитель веществ. В то время как соединение I уже на 30 минуте достоверно (Р<0,05) замедляло темпы прироста глюкозы в крови подопытных крыс. По показателям изменения площади под кривой глюкозной нагрузки соединение I превосходило препарат сравнения гликлазид.

Таблица 3 Влияние гликлазида и соединения I при внутрижелудочном введении на уровень глюкозы в крови крыс с экспериментальным сахарным диабетом (стрептозотоцин 30 мг/кг внутрибрюшинно) на фоне пероральной нагрузки глюкозой (3 г/кг) (М±m) Исследуемые группы Ед. изм. Интервалы времени (мин) Площадь под кривой (у.е.) -120 0 30 60 90 120 Содержание глюкозы в крови Интактные крысы (контр. 1) мМ 4,25±0,14 3.93±0,08 5,19±0,12 5,07±0,20 4,58±0,15 3,95±0,12 504,61 %   -7,5 +32,1 +29,0 +16,5 +0,5   Диабет (контр.2) мМ 5,50±0,29 4,87±0,22 8,13±0,38 7,93±0,43 7,31±0,40 6,09±0,26 792,28 % к К1 +29,4 * +23,9* +56,6* +56,4* +59,6* +54,1*   %   -11,4 +66,9 +62,8 +50,1 +25,1   Диабет + Гликлазид (25 мг/кг) мМ 4,43±0,28 2,78±0,05 4,93±0,22 4,76±0,14 4,31±0,07 3,40±0,04 595,83 %   -37,2** +77,34 +71,22⁺ +55,04⁺ +22,25⁺   Диабет + соедине-
ние I(25 мг/кг) мМ 4,57+0,17 3,93±0,13 5,87±0,29 5,40±0,35 4,67±0,26 4,37±0,23 543,75 %   -14,1** +49,4+ +37,4⁺ +18,8⁺ +11,2⁺   * - изменения достоверны по сравнению с контролем 1 (Р<0,05)
+ - изменения достоверны по сравнению с контролем 2 (Р<0,05)
** - изменения достоверны по сравнению с исходными данными (Р<0,05)

По результатам проведенных исследований можно утверждать, что соединение I улучшает сниженные показатели толерантности к глюкозе.

Исследования на животных с экспериментальным ожирением

Ожирение моделировали у старых крыс самцов (возраст 2 года, массой до начала эксперимента 290-350 г), находящихся более трех месяцев на субкалорийной диете с повышенным содержанием жиров (более 80% от общей калорийности рациона и углеводами с высоким гликемическим инсулином. В течение указанного периода животных не ограничивали в пище. В исследование отбирали животных с нарушенной толерантностью к глюкозе и сниженной чувствительностью к инсулину (по пробе Химсворда). Пероральный глюкозотолерантный тест проводили по утрам после ночного (в течение 10-14 ч) голодания животных при интрагастральном введении раствора глюкозы в дозе 3 г/кг. Содержание глюкозы в крови крыс определяли глюкозооксидазным методом, используя наборы Био-Ла-Тест (Чехия, Лахема диагностика).

Животных с ожирением, у которых диагностировали нарушение толерантности к углеводам и синдром инсулинрезистентности, делили на две группы, одна из которых служила контролем, а животным другой вводили исследуемое вещество и наблюдали за изменениями уровня глюкозы в течение двух часов до глюкозной нагрузки и двух часов после нее. Результаты исследования гипо- и антигипергликемического действия изучаемого соединения I представлены на фиг.2 и в табл.4.

Соединение I через 2 часа после введения оказывало гипогликемическое действие в пределах 10%. После нагрузки глюкозой тенденция к снижению уровня глюкозы сохранилась. Следует отметить, что антигипергликемический эффект, наблюдаемый на протяжении всего эксперимента, был стабильным. Достоверные отличия по сравнению с животными контрольной группы наблюдались после 30 минуты перорально введенной глюкозы.

Таблица 4 Влияние соединения I (25 мг/кг) при внутрижелудочном введении на уровень глюкозы в крови крыс с нарушенной толерантностью к углеводам и инсулинорезистентностью на фоне пероральной нагрузки глюкозой (3 г/кг) (М±m) Исследуемые группы Ед. изм. Интервалы времени (мин) -120 0 30 60 90 120 Содержание глюкозы в крови Интактные крысы (контроль 1) мМ 4,25±0,14 3,93±0,08 5,19±0,12 5,07±0,20 4,58±0,15 3,95±0,12 %   -7,5 +32,1 +29,0 +16,5 +0,5 Крысы с нарушенной толерантностью к углеводам (контроль 2) мМ 4,15±0,11 3,77±0,21 4,93±0,21 5,22±0,24 5,43±0,33 5,20±0,15 %   -9,2 +30,8 +38,5 +44,0 +37,9 % к К1 -2,4 -4,1 -5,3 +2,9 +18,6* +31,6* Крысы с нарушенной толерантностью к углеводам + соединение I (25 мг/кг) мМ 4,30±0,17 3,87±0,07 5,30±0,15 4,63±0,19 4,23±0,19 4,37±0,09 %   -10,0 +37,0 +19,6 +9,3⁺ +12,9⁺ * - изменения достоверны по сравнению с контролем 1 (Р<0,05)
+ - изменения достоверны по сравнению с контролем 2 (Р<0,05)

Оценка эффективности соединения I у крыс с экзогенной гиперинсулинемией (модель инсулинорезистентности)

Синдром инсулинорезистентности воспроизводили по методу Гордиенко О.Е. с соавторами (Гордиенко О.Е., Мертвецов Н.П., Салганик Р.И. Нарушение толерантности к глюкозе у крыс при длительном введении инсулина - Проблемы эндокринологии. - 1973. - Т.19. - №6. - С.83-91) на белых беспородных крысах массой 160-220 г. Животным на протяжении 27 дней ежедневно подкожно вводили протамин-цинк-инсулин (Elli-Zilly, США) из расчета 2 ЕД/животное. Для исследования отбирали животных с нарушенной толерантностью к глюкозе. Инсулинорезистентность определяли, используя пробу Химсворда (Цюхно З.И., Славнов В.И., Панченко Н.И. и др. Функциональные методы исследования в эндокринологии, Киев: Здоровье. - 1981. - 240 с.). Пероральный глюкозотолерантный тест проводили по утрам после ночного (в течение 10-14 ч) голодания животных при интрагастральном введении раствора глюкозы в дозе 3 г/кг. Содержание глюкозы в крови крыс определяли глюкозооксидазным методом, используя наборы Био-Ла-Тест (Чехия, Лахема диагностика).

Животных с нарушенной толерантностью к углеводам (по результатам проведения глюкозотолерантного теста) и синдромом инсулинрезистентности (диагностика с использованием пробы Химсворда) делили на две группы: первой вводили однократно перорально исследуемое соединение, второй группе - растворитель изучаемого вещества. За динамикой изменений уровня глюкозы в крови начинали наблюдать через 2 часа после введения соединений, а затем на фоне перорального глюкозотолерантного теста глюкозой еще в течение последующих двух часов, отбирая пробы крови через каждые 30 минут.

Результаты по изучению влияния соединения на уровень глюкозы в крови крыс с нарушенной толерантностью к углеводам после длительного введения инсулина представлены на фиг.3 и в табл.5.

По исходному содержанию глюкозы контрольные животные и крысы, получавшие исследуемое вещество, практически не различались (4,15±0,11 ммоль/л, 4,30±0,17 ммоль/л соответственно). При анализе проб крови, которые отбирали через 2 часа после начала эксперимента и через 30 минут после введения глюкозы, достоверных различий у животных контрольной (-9,16% и +18,8%) и опытной групп (-10,0% и +23,26%) также не было обнаружено. Однако по истечение следующих 30 минут было отмечено антигипергликемическое действие соединения I, которое носило достоверный характер (Р<0,05). Прирост глюкозы снизился в 2 раза по сравнению с группой контрольных крыс. Между 60 и 90 минутами эффект продолжал нарастать и к полутора часам после моделирования гипергликемии достигал всего +9,30% против +44,03% в контроле (Р<0,05). К 120 минуте, что соответствовало 4 часу эксперимента, уровень глюкозы стал несколько повышаться, однако разница между приростом глюкозы, в процентном выражении, в группе животных, получавших препарат I, и контрольных крыс по-прежнему оставалась в пределах 60% (Р<0,05). Значения концентрации глюкозы у животных, получавших вещество, практически приблизились к исходным данным, в то время как у крыс контрольной группы превышали на 25% содержание глюкозы, отмеченное в начале эксперимента.

Таким образом, антигипергликемический эффект подтверждает присутствие у вещества I помимо панкреотропного действия, которое не может быть реализовано на данной экспериментальной модели, экстрапанкреатических эффектов.

Таблица 5 Влияние соединения I (25 мг/кг) при внутрижелудочном введении на уровень глюкозы в крови крыс с нарушенной толерантностью к углеводам (старые животные с ожирением) после пероральной нагрузки глюкозой (3 г/кг) (М±m) Исследуемые группы Ед. изм. Интервалы времени (мин) -120 0 30 60 90 120 Содержание глюкозы в крови Интактные крысы (контроль 1) мМ 4,25±0,14 3,93±0,08 5,19±0,12 5,07±0,20 4,58±0,15 3,95±0,12 %   -7,5 +32,1 +29,0 +16,5 +0,5 Крысы с нарушенной толерантностью к углеводам (контроль 2) мМ 4,27±0,22 4,26±0,29 5,51±0,35 5,54±0,32 5,47±0,37 5,23±0,36 %   -0,2 +29,3 +30,1 +28,4 +22,8 % к К1 +0,5 +8,4 +6,2 +9,3 +19,4* +32,4* Крысы с нарушенной толерантностью к углеводам + соединение I (25 мг/кг) мМ 4,75±0,15 4,30±0,12 4,75±0,25 4,70±0,10 4,60±0,10 4,65±0,25 %   -9,5 +10,5 +9,3⁺ +7,0⁺ +8,1 * - изменения достоверны по сравнению с контролем 1 (Р<0,05)
+ - изменения достоверны по сравнению с контролем 2 (Р<0,05)

Влияние соединения I на сахароснижающее действие экзогенно введенного инсулина

Одним из косвенных показателей повышения чувствительности тканей организма к инсулину может быть влияние новых веществ на выраженность гипогликемического действия инсулина в опытах на животных с удаленной поджелудочной железой по схеме В.A.Houssay (1960).

Опыты проводили на 5-ти панкреатэктомированных собаках массой 8,6-11,5 кг. Удаление поджелудочной железы проводили под гексеналовым наркозом (50 мг/кг внутрибрюшинно) в асептических условиях. Исследование проводили на 3-4 день после операции, когда содержание глюкозы достигло 23-26 ммоль/л. К этому времени животные худели, у них развивалась полиурия, полидипсия, полифагия, т.е. клинические признаки, характерные для тяжелой формы сахарного диабета, основной причиной развития которого является дефицит инсулина. Влияние соединения I на сахароснижающий эффект инсулина проводили в три этапа.

1. Изучали влияние соединения I на глюкозу крови у панкреатэктомированных собак. Исследуемое вещество I вводили животным однократно внутривенно в дозе 5 мг/кг. Сахароснижающее действие соединения изучали на протяжении 6 часов. Пробы крови забирали через каждый час.

2. Изучали сахароснижающее действие инсулина для инъекций (Минмедпром, Московский эндокринный завод), введенного многократно внутривенно в дозе 0,04 ЕД/кг в течение 3-х часов с 30-минутными интервалами.

3. Изучали влияние инсулина в комплексе с соединением I на содержание глюкозы крови. Вещество в дозе 5 мг/кг вводили внутривенно с первой порцией инсулина. Наблюдение за содержанием глюкозы в крови опытных животных продолжали до исчезновения гипогликемического эффекта. Пробы крови отбирали через каждый час на протяжении всего эксперимента. Обобщенные данные по влиянию инсулина и вещества I, введенным отдельно, и инсулина, введенного в комплексе с соединением I, на концентрацию глюкозы в крови панкреатэктомированных собак приведены на фиг.4.

Соединение не влияло на содержание глюкозы в крови у собак с удаленной поджелудочной железой. Так, изменения концентрации глюкозы колебались в пределах 2,7-4,6% и были статистически не достоверны. После введения инсулина панкреатэктомированным собакам через час гормон снизил содержание глюкозы в крови на 23%. Гипогликемический эффект продолжал нарастать и через 2 часа был максимально выражен, содержание глюкозы в крови собак к этому времени равнялось 16,6 ммоль/л вместо исходных 23,2 ммоль/л, что соответствовало снижению глюкозы в крови опытных животных на 28%. На 3-м часу эксперимента у 3-х из 5-ти собак глюкоза в крови удерживалась на этом уровне, однако (по обобщенным данным) прослеживалась тенденция к ее стабилизации, которая наблюдалась в последующее время. Между 5-м и 6-м часом эксперимента концентрация глюкозы в крови достигла исходного уровня, а через 6 часов у 3-х собак даже несколько превысила концентрацию глюкозы, которая отмечалась в крови животных до начала эксперимента. При совместном введении инсулина для инъекций с соединением I концентрация глюкозы в крови собак через час снизилась на 23%, что соответствовало гипогликемическому эффекту инсулина. Ко 2-му часу эксперимента наблюдалось усиление сахароснижающего действия инсулина, которое к 3-му часу после введения стало статистически значимым. Максимальное снижение глюкозы на 46% отмечалось к 4-5 часу наблюдения. Гипогликемическое действие инсулина, введенного в комплексе с соединением I в 2,7 раза превысило сахароснижающий эффект, который наблюдался при введении одного инсулина. Через 6 часов концентрация глюкозы в крови начала повышаться и к 9-му часу эксперимента содержание глюкозы в крови нормализовалось.

Таким образом, снижение уровня глюкозы в крови панкреатэктомированных собак под влиянием инсулина, введенного вместе с соединением, было более интенсивным и длительным, чем при применении одного инсулина.

Проведенные исследования дают основание сделать заключение, что изучаемое вещество повышает чувствительность тканей к действию инсулина.

Таким образом, на основании проведенных исследований можно сделать вывод о том, что изучаемое соединение I снижает инсулинорезистентность тканей организма и восстанавливает толерантность организма к углеводам в условиях патологии углеводного обмена. Вероятно, выявленный эффект соединения I связан с его свойством повышать чувствительность тканей организма к действию инсулина.

Гемореологические свойства заявленного соединения I

Гемореологические изменения оценивали по двум важным показателям - вязкость крови и способность эритроцитов к агрегации, индуцированной алциановым голубым в условиях экспериментальной патологии - стрептозотоцинового диабета.

Синдром гипервязкости вызывали внутрибрюшинным введением стрептозотоцина («Serva», Германия) в дозе 40 мг/кг (Баранов В.Г. Экспериментальный сахарный диабет. Ленинград: Наука, 1983 - 216 С.). В опыт брали животных, у которых развивалась стойкая гипергликемия (не менее 17 ммоль/л). Исследуемые вещества, растворенные в физиологическом растворе, вводили крысам внутрижелудочно в течение семи дней в дозе 5 мг/кг. Контрольные животные получали эквивалентный объем растворителя. Пробы крови для исследования гемореологических показателей забирали из брюшного отдела аорты крыс, находящихся под тиопенталовым наркозом (40 мг/кг), который по данным литературы не влияет на реологические параметры крови (Галенок В.А., Гостинская Е.В, Диккер В.Е. Гемореология при нарушениях углеводного обмена - Новосибирск: Наука, 1987. - 342.).

Измерение вязкости крови проводили на реологическом анализаторе крови АКР-2 (Россия) при семи скоростях сдвига, моделирующих различную интенсивность кровотока в сосудах (Анализатор вязкости крови / Н.А.Добровольский, Ю.М.Лопухин, А.С.Парфенов и др. // Реологические исследования в медицине: Сб. науч. тр. - М.: НЦХ РАМН, 1998. - С.45-51). Производилась стандартизация образцов крови к единому гематокриту 45% путем добавления или изъятия необходимого количества плазмы.

Индекс агрегации эритроцитов (ИАЭ) получали расчетным путем - отношением вязкости крови при 20°С к вязкости крови при 200 с^-1 (Dintenfass L. Modifications of blood rheology during aging and agerelated pathological conditions // Aging (Milano). - 1989. - №1. - P.99-125). Агрегацию эритроцитов изучали на двухканальном лазерном анализаторе агрегации (модель 220LA) научно-производственной фирмы «Биола» (Россия) (Спасов А.А., Островский О.В., Кучерявенко А.Ф., Дегтярев А.Н. Изучение агрегации эритроцитов на лазерном агрегогметре // Клиническая лабораторная диагностика. - 2000. - №5. - С.21-23).

Исследование агрегационной способности эритроцитов проводили на отмытых красных кровяных клетках, используя в качестве агрегирующего агента 50 мкМ водный раствор алцианового голубого («Sigma», США).

Результаты эксперимента представлены в табл.6 и в табл.7.

Таблица 6 Влияние соединения I и препарата сравнения гликлазида на вязкость крови (сП) крыс со стрептозотоциновым диабетом при различных скоростях сдвига (при семидневном внутрижелудочном введении в дозе 5 мг/кг) (М±m) N п/п Изучаемые соединения и препараты Вязкость крови при различных скоростях сдвига ИАЭ 200 с^-1 100 с^-1 20 с^-1 1. Контроль 3,93±0,09 4,03±0,09 5,95±0,04 1,51 2. Соединение I 3,52±0,05* 3,6±0,06* 4,45±0,10*^♣ 1,26 3. Гликлазид 3,7±0,06* 3,77±0,06 4,95±0,10* 1,33 * - данные достоверны по отношению к контролю (р<0,05)
^♣ - данные достоверны по отношению к гликлазиду (р<0,05)
ИАЭ - индекс агрегации эритроцитов

Таблица 7 Влияние соединения I и препарата сравнения гликлазида на алциан-индуцируемую агрегацию эритроцитов крови крыс со стрептозотоциновым диабетом (при семидневном внутрижелудочном введении в дозе 5 мг/кг) (М±m) №п/п Изучаемые соединения и препараты Агрегация эритроцитов, Δ% по отношению к контролю 1. Соединение I -78,76±2,05*^♣ 2. Гликлазид -53,66±2,59* * - данные достоверны по отношению к контролю (р<0,05)
^♣ - данные достоверны по отношению к гликлазиду (р<0,05)

Так, в результате проведенного исследования было показано, что соединение I снижает вязкость крови крыс со стрептозотоциновым диабетом, при этом по активности превосходя препарат сравнения гликлазид.

Таким образом, заявленное соединение I оказывает выраженное гемореологическое свойство, ранее не известное (не описанное), которое заключается в снижении агрегации эритроцитов и нормализации реологических свойств крови (вязкость крови) у крыс с синдромом гипервязкости.

Изучение острой токсичности соединения I и фармацевтической композиции

Среднесмертельную дозу (ЛД₅₀) субстанции и лекарственной формы определяли по Арзамасцеву Е.В. с соавторами (Арзамасцев Е.В., Гуськова Т.А., Березовская И.В. и др. - Методические указания по изучению общетоксичекого действия фармакологических веществ.- Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общей редакцией члена-корреспондента РАМН, профессора Р.У.Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - С.170-204). Эксперименты были выполнены на белых нелинейных крысах обоего пола массой 180-200 г. Препарат I вводили однократно перорально, крысам-самцам в дозах 1000, 1500, 3000, 4000, 5000 мг/кг, крысам-самкам в дозах 1200, 1500, 3000, 5000, 6000 мг/кг. Сразу после введения исследуемого вещества животные находились под постоянным наблюдением в течение 4-х часов, в последующие дни за ними наблюдали два раза в сутки: утром и вечером. Длительность эксперимента составила 14 дней. Оценку общего состояния и поведения животных проводили по следующим показателям: характеру двигательной активности, координации движений, наличию судорог и их характеру, наличию тремора, рефлекторных реакций на внешние раздражители - звуковые (постукивание по клетке), тактильные (прикосновение к коже), оценивали состояние шерстяного покрова (шерсть взъерошенная или гладкая, блестящая или тусклая). По окончании срока наблюдения подсчитывали процент павших и выживших животных и вычисляли ЛД₅₀ по методу Litchfild и Wilcoxon (Беленький М.Л. - В кн.: Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. - Л., 1968. - 151 с.).

По результатам исследований острой токсичности вещества I установлены уровни его летальных доз, различные для крыс-самок и самцов, и характерные признаки интоксикации.

Животные начинали гибнуть уже при употреблении ими соединения I в дозе 1500 мг/кг. Однако случаи гибели были единичными, и картина отравления не была четко выражена. Начиная с дозы 3000 мг/кг и заканчивая дозой 6000 мг/кг, у всех животных наблюдались признаки отравления. Картина отравления и гибели животных была примерно одинаковой во всех группах животных. Разница заключалась лишь в количестве погибших животных, зависящем от дозы употребляемого препарата, быстроте развития симптомом отравления и сроках наступления смерти. После введения препарата отмечалась резкая седация, снижение двигательной активности вплоть до полной неподвижности, затем возникали клонические судороги, и животное погибало. У животных, оставшихся в живых, на следующие сутки отмечалась вялость, снижение двигательной и пищевой активности.

На основании полученных данных по изучению острой токсичности субстанции препарата I была рассчитана среднесмертельная доза (ЛД₅₀). Также была определена среднесмертельная доза для лекарственной формы соединения I. Обобщенные данные острой интоксикации, вызываемой у крыс при пероральном введении изучаемого препарата, приведены в табл.8.

По результатам проведенных исследований дигидрохлорид I можно отнести к малотоксичным веществам. По сравнению с противодиабетическими препаратами (табл.9), применяемыми в клинической практике для лечения инсулиннезависимого сахарного диабета, он менее токсичен, чем производные гуанидина - препарата метформина, и практически равен по данному показателю производным сульфонилмочевины I и II генерации.

Таблица 8 Влияние соединения I и фармацевтической композиции при однократном пероральном введении на гибель крыс Название препаратов Среднесмертельная доза (ЛД₅₀) мг/кг Самки Самцы Субстанция соединения I 2321,0 (1646,27-3273,01) 2740,91 (2017,54-3723,62) Композиция 3569,46 (2730,59-4666,05) 3554,45 (2320,17-5445,33) Таблица 9 Среднесмертельная доза (ЛД₅₀) антидиабетических препаратов при пероральном введении (данные литературы) Название препарата ЛД₅₀, мг/кг Автор Толбутамид 2500 Галлер Г. и др., 1973° Хлорпропамид 2390 Галлер Г. и др., 1973° Гликлазид 3000 Duhault J. et al.,1972°° Метформин 1000 Галлер Г. и др., 1973° ° - Галлер Г., Штрауцерберг С. Пероральная терапия диабета. - М.: Медицина, 1973. - 298 с.
°° - Duhault J., Baulanger М., Beregi L. The pharmacology of S 1702. A new highly effective oral antidiabetic drug with unusual properties. - Arzneim. Forsch. - 1972. - V.22. - P.1682-1685.

Настоящее изобретение относится к применению дигидрохлорида 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а] бензимидазола в качестве соединения, подавляющего агрегацию эритроцитов и снижающего вязкость крови, а также снижающего инсулинорезистентность и восстанавливающего толерантность организма к глюкозе. Также изобретение относится к фармацевтической композиции на основе указанного дигидрохлорида. Технический результат: изучены новые возможности указанного соединения. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 9 ил., 9 табл.

1. Применение дигидрохлорида 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а]бензимидазола формулы I

в качестве соединения, подавляющего агрегацию эритроцитов и снижающего вязкость крови, а также снижающего инсулинорезистентность и восстанавливающего толерантность организма к глюкозе.

2. Фармацевтическая композиция, снижающая инсулинорезистентность и восстанавливающая толерантность организма к глюкозе при сахарном диабете, преддиабете, синдроме инсулинорезистентности и ожирении, а также подавляющая агрегацию эритроцитов и снижающая вязкость крови, включающая в качестве активного начала дигидрохлорид 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а]бензимидазола формулы I:

взятый в эффективном количестве.

3. Фармацевтическая композиция по п.2, отличающаяся тем, что содержит вспомогательные вещества при следующем соотношении ингредиентов, вес.%:
Дигидрохлорид 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а]бензимидазола, 20-92
Крахмал, и/или поливинилпирролидон М.м. 7800-35000 (ПВП),   и/или натрий карбоксиметилцеллюлоза (NAKMЦ),   или оксипропилметилцеллюлоза (ОПМЦ) 7-40 Кальция и/или магния стеараты 0,3-1,0 Микрокристаллическая целлюлоза (мкц) и/или лактоза Остальное