ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ЕССОТОКСИНОВ В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРОВ РОСТА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2010 года по МПК A61K31/35 A61P35/00 

Настоящее изобретение относится к терапевтическому применению ессотоксинов в качестве цитотоксического агента для опухолевых клеток благодаря их способности активировать клеточные фосфодиэстеразы.

Ессотоксин, называемый далее в данном описании YTX, и его природные аналоги представляют собой полициклические эфиры, продуцируемые динофлагеллятами видов Protoceratium reticulatum и Lingolodinium polyedrum, и первоначально они были выделены из пищеварительного аппарата Patinopecten yessoensis (Murata, M., Kumagai, M. et al., 1987, Tetrahedron Letters, 28, 5869-5872). Его молекула, представленная на чертеже, образована одиннадцатью кольцами с эфирными группами и ненасыщенной боковой цепью, имеющей связанные с ней различные радикалы. На этом чертеже показаны некоторые аналоги YTX, хотя существует более 50 природных производных аналогов.

YTX является липофильным соединением, которое нетоксично при пероральном приеме (Aune, Т., Sorby, R. et al., 2002, Toxicon, 40, 77-82); однако оно вызывает гибель после внутрибрюшинной инъекции (Tubaro, A., Sosa, S. et al., 2003, Toxicon, 41, 783-92), хотя для этого требуется очень высокая доза.

YTX и их аналоги обладают механизмом действия, который отличается от механизма действия другого токсина. Первоначально они были классифицированы в группу токсинов, вызывающих диарею, поскольку их часто обнаруживают вместе; однако они отличаются тем, что они не вызывают диарею, а также не воздействуют на клеточные фосфатазы, представляющие собой клеточную мишень токсинов, вызывающих диарею. Их механизм действия относится к другим ферментам; в этой связи было описано, что YTX снижает уровни циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) в цитозоле, поскольку он повышает активность клеточных фосфодиэстераз посредством кальцийзависимого механизма (Alfonso, A., de la Rosa, L.A. et al., 2003, Biochem. Pharmacol., 65, 193-208). Кроме того, YTX повышает уровни кальция в цитозоле посредством стимуляции его поступления через канал, локализованный в клеточной мембране (De la Rosa, LA., Alfonso, A. et al., 2001, Biochem. Pharmacol., 61, 827-833; De la Rosa, LA, Alfonso, A. et al., 2001, Cell Signal, 13, 711-716). Эффект в отношении фосфодиэстераз был использован для разработки чувствительных способов обнаружения присутствия этих токсинов в контаминированных моллюсках, которые были недавно опубликованы (Alfonso, A., Vieytes, M.R. et al., 2004, Analytical Biochem., 326, 93-99; Pazos, M.J., Alfonso, A. et al., 2004, Analytical Biochem., 335, 112-118). Существует одиннадцать семейств фосфодиэстераз, которые очень важны с фармакологической точки зрения, поскольку их модулирование вовлечено в лечение заболеваний, таких как астма, ревматоидный артрит и рак (Houslay, M.D. and Adams, D.R., 2003, Biochem. J. 370,1-18).

YTX индуцирует апоптоз, программируемую клеточную гибель, в клетках нейробластомы человека и в клетках рака шейки матки человека (линия HeLa) вследствие активации каспазы (Leira, F., Alvarez, С.et al., 2001, Toxicology in vitro, 15, 277-283; Malaguti, С., Ciminello, P. et al., 2002, Toxicol in Vitro, 16, 357-363). Кроме того, этот токсин обладает цитотоксическим действием на клетки печеночно-клеточного рака человека (HEP-G2) и клеток HeLa229; следовательно, априори допустимо его применение в качестве противоопухолевого лекарства.

Биохимический путь цАМФ, обусловленный и уровнями этого вторичного мессенджера, и активацией, имеющей место в отношении протеинкиназы А, вовлечен в пролиферацию клеток. Ингибирование протеинкиназы А дает противоопухолевую активность (Wang, H., Cai, Q. et al., 1999, Proc Natl Acad Sci USA, 96, 13989-94), хотя было также описано, что устойчивость к противоопухолевым лекарствам, таким как цисплатин, связана с инактивацией этого белка (Cvijic, M.E., Yang, W.L et al., 1998, Pharmacol Ther, 78, 115-28). К тому же, уровни цАМФ в свою очередь связаны с цитотоксичностью и устойчивостью к лекарствам (Mann, S.C., Andrews, Р.А. et al., 1991, Int J Cancer, 48, 866-72; von Knethen, A., Lotero, A. et al., 1998, Oncogene, 17, 387-94). Другими словами, биохимический путь цАМФ играет важную и сложную роль в регуляции роста клеток. По этой причине описание природных или синтетических молекул, влияющих на фосфодиэстеразы, и способов исследования активности этих ферментов, которые можно применять в протоколах ВПС (высокопроизводительного скрининга), является очень полезным инструментом для открытия новых терапий. В этом смысле описание ингибирующего эффекта YTX в отношении роста опухолевых клеток указывает на фармакологическую значимость этих молекул для их возможного терапевтического применения. Кроме того, некоторые авторы подчеркивают, что YTX

благодаря их низкой токсичности не следует считать токсином, а скорее природным продуктом с различными фармакологическими применениями.

Более глубокое объяснение семейств токсинов, конкретных характеристик YTX и механизма их действия приведено в описании основной заявки и выделенных заявок, относящихся к настоящему изобретению.

В предложенном изобретении описано применение YTX в качестве ингибитора клеточного роста в соответствии с их способностью активировать клеточные фосфодиэстеразы.

ПРИМЕНЕНИЕ: Применение активирующих фосфодиэстеразы YTX и соединений в качестве ингибиторов пролиферации опухолевых клеток

Ингибирование роста опухолевых клеток является индикатором противоопухолевой активности, широко используемым для описания противоопухолевых свойств новых лекарств. Обнаружено, что YTX является цитотоксическим для клеток печеночно-клеточного рака человека, и, кроме того, было описано, что этот токсин индуцирует апоптоз в клетках нейробластомы (Leira, F., Alvarez, С. et al., 2001, Toxicology in vitro, 15, 277-283), причем все эти данные указывают на то, что YTX допустим для применения в качестве противоопухолевого лекарства. Эффективность YTX в качестве цитотоксического лекарства для опухолевых клеток печеночно-клеточного рака определяют количественно в настоящем применении. Ингибирование роста клеток можно определить в соответствии с различными протоколами, описанными в литературе. Один из этих протоколов изложен ниже, в котором ответ определяют количественно в клеточной линии HEP-G2 посредством окрашивания кристаллическим фиолетовым и последующего ацетилирования.

ВОПЛОЩЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

а) Клетки HEP-G2 высевают на микротитровальный планшет при плотности 10000 клеток на лунку. Клетки инкубируют в течение 24 часов с ростовой средой при 37°С и 5% СО₂.

б) Добавляют различные концентрации YTX и инкубируют в течение 48 часов при 37°С и 5% СО₂.

в) Добавляют 10 мкл 11%-ного глутаральдегида для фиксации клеток и инкубируют в течение 15 минут. Их промывают 3-4 раза дистиллированной водой.

г) Добавляют 0,1%-ного раствор кристаллического фиолетового и планшет встряхивают в течение 15 минут.

д) Краситель удаляют путем промывания дистиллированной водой, а затем сушат.

е) Добавляют 10%-ную уксусную кислоту и встряхивание поддерживают в течение 15 минут.

ж) Поглощение считывают на спектрофотометре при 595 нанометрах.

з) С помощью этого протокола было обнаружено, что 10 мкМ YTX индуцируют ингибирование роста клеток примерно на 82+/-1%.

Результаты по индуцированию ингибирования роста клеток

Концентрация YTX (М) % ингибирования роста клеток SEM 1,0000е^-5 80 1 1,0000е^-6 60 2 1,0000е^-7 57 2 1,0000е^-8 47 4 1,0000е^-9 9 2 1,0000е^-10 6 1 1,0000е^-11 1 1 1,0000е^-12 1 1 1,0000е^-13 1 1

ЛИТЕРАТУРА

1. Alfonso, A., de la Rosa, L.A., Vieytes, М.R., Yasumoto, T. and Botana, L.М. (2003). "Yessotoxin a novel phycotoxin, activates phosphodiesterase activity. Effect of yessotoxin on cAMP levels in human lymphocytes." Biochem. Pharmacol. 65: 193-208.

2. Alfonso, A., Vieytes, M.R., Yasumoto, T. and Botana, L.M. (2004). "A rapid microplate fluorescent method to detect yessotoxins based on their capacity to activate phosphodiesterases." Analytical Biochem. 326: 93-99.

3. Aune, Т., Sorby, R., Yasumoto, Т., Ramstad, H. and Landsverk, T. (2002). "Comparison of oral and intraperitoneal toxicity of yessotoxin towards mice." Toxicon 40(1): 77-82.

4. Cvijic, M.E., Yang, W.L. and Chin, K.V. (1998). "Cisplatin resistance in cyclic AMP-dependent protein kinase mutants." Pharmacol Ther 78(2): 115-28.

5. De la Rosa, L.A., Alfonso, A., Vilarino, N., Vieytes, M.R. and Botana, L.M. (2001). "Modulation of cytosolic calcium levels of human lymphocytes by yessotoxin, a novel marine phycotoxin." Biochem. Pharmacol. 61(7): 827-833.

6. De la Rosa, L.A., Alfonso, A., Vilarino, N., Vieytes, M.R., Yasumoto, T. and Botana, L.M. (2001). "Maitotoxin-induced calcium entry in human lymphocytes - Modulation by yessotoxin, Ca2+ channel blockers and kinases." Cell Signal 13(10): 711-716.

7. Houslay, M.D. and Adams, D.R. (2003). "PDE4 cAMP phosphodiesterases: modular enzymes that orchestrate signalling cross-talk, desentization and compartmentalization." Biochem J. 370: 1-18.

8. Leira, F., Alvarez, C., Vieites, J.M., Vieytes, M.R. and Botana, L.M. (2001). "Okadaic acid and yessotoxin induce caspase-3 mediated apoptosis in neuroblastoma cells. Characterization of distinct apoptotic changes induced by these phycotoxins in the BE(2)-M17 cell line by means of new fluorimetric microplate assays." Toxicology in vitro 15: 277-283.

9. Malaguti, С., Ciminello, P., Fattorusso, E. and Rossini, G.P. (2002). "Caspase activation and death induced by yessotoxin in HeLa cells." Toxicol in Vitro 16(4): 357-363.

10. Mann, S.С., Andrews, P.A. and Howell, S.B. (1991). "Modulation of cis-diamminedichloroplatinum(ll) accumulation and sensitivity by forskolin and 3-isobutyl-1-methylxanthine in sensitive and resistant human ovarian carcinoma cells." Int J Cancer 48(6): 866-72.

11. Murata, M., Kumagai, M., Lee, J.S. and Yasumoto, T. (1987). "Isolation and structure of Yessotoxin, a novel polyether compound implicated in diarrhetic shellfish poisoning." Tetrahedron Letters 28: 5869-5872.

12. Pazos, M.J., Alfonso, A., Vieytes, M.R., Yasumoto, Т., Vieites, J.M. and Botana, L.M. (2004). "Resonant mirror biosensor detection method based on yessotoxin-phosphodiesterase interactions." Analytical Biochem. 335: 112-118.

13. Tubaro, A., Sosa, S., Carbonatto, M., Altinier, G., Vita, F., Melato, M., Satake, M. and Yasumoto, T. (2003). "Oral and intraperitoneal acute toxicity studies of yessotoxin and homoyessotoxins in mice." Toxicon 41(7): 783-92.

14. von Knethen, A., Lotero, A. and Brune, B. (1998). "Etoposide and cisplatin induced apoptosis in activated RAW 264.7 macrophages is attenuated by cAMP-induced gene expression." Oncogene 17(3): 387-94.

15. Wang, H., Cai, Q., Zeng, X., Yu, D., Agrawal, S. and Zhang, R. (1999). "Antitumor activity and pharmacokinetics of a mixed-backbone antisense oligonucleotide targeted to the RIalpha subunit of protein kinase A after oral administration." Proc NatI Acad Sci USA 96(24): 13989-94.

Изобретение относится к области биологии и медицины. Предложено терапевтическое применение ессотоксинов в качестве ингибиторов роста опухолевых клеток человека. Механизм действия ессотоксина (YTX) связан с активацией клеточных фосфодиэстераз и соответственно со снижением уровней цАМФ в цитозоле. Результатом этой активации после введения YTX является ингибирование роста клеток печеночно-клеточного рака человека. Этот цитотоксический эффект YTX в отношении опухолевых клеток можно применять в качестве стратегии для разработки лекарств, полезных при лечении опухолевых процессов. 2 з.п.ф-лы, 1 табл. 1 ил.

1. Применение ессотоксинов (YTXs) в качестве активаторов фосфодиэстераз в отношении опухолевых клеток с измененной активностью фосфодиэстераз.

2. Применение ессотоксинов (YTXs) по п.1 для модулирования жизнеспособности и роста опухолевых клеток.

3. Применение ессотоксинов (YTXs) по п.1 в изготовлении композиций для лечения новообразований, в которые вовлечено модулирование фосфодиэстеразы.