БЕСКОНТАКТНЫЕ СПОСОБЫ ОБНАРУЖЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОЛОНИЙ, НАБОРЫ РЕАГЕНТОВ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ИХ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 2010 года по МПК C12Q1/68 C12N15/10 

Текст описания приведен в факсимильном виде.

Изобретение относится к способам праймер-зависимого размножения нуклеиновых кислот в иммобилизованных средах, в частности, к способам обнаружения продуктов такого размножения. В изобретении предложен усовершенствованный способ идентификации, обнаружения изменений в нуклеотидной последовательности и определения числа молекул нуклеиновых кислот как отдельных молекул, так и содержащихся в клетках или во фрагментах ткани. Изобретение позволяет обнаруживать молекулярные колонии нуклеиновых кислот с помощью флуоресценции по мере роста колоний в иммобилизованной среде (в реальном времени) без осуществления дополнительной стадии гибридизации и без разгерметизации камеры, в которую заключена среда. Если колония образована более чем одной молекулой мишени, изобретение позволяет определить количество молекул мишени, давших начало данной колонии. Это, в свою очередь, позволяет определить пространственную локализацию и локальную концентрацию молекул РНК или ДНК данного вида в клетках или во фрагментах ткани, заключенных в гель на стадии полимеризации. Изобретение может найти широкое применение в качестве метода диагностики и инструмента научных исследований. 4 н. и 51 з.п. ф-лы, 11 ил.

1. Способ обнаружения и определения количества нуклеиновых кислот, включающий (а) приготовление образца, предположительно содержащего хотя бы один вид определяемой нуклеиновой кислоты (мишени) в форме, пригодной для экспоненциального размножения, (б) введение образца в реакционный контейнер устройства для бесконтактной детекции продуктов размножения нуклеиновых кислот с помощью флуоресценции, содержащий также водную среду, включающую бесклеточную ферментную праймер-зависимую систему экспоненциального размножения нуклеиновых кислот, способную размножать хотя бы один участок данной мишени, и гомогенную флуоресцентную систему детекции мишень-специфичных продуктов размножения, (в) герметизацию контейнера, обеспечивающую предотвращение испарения воды и утечки продуктов размножения, (г) инкубацию контейнера в условиях, обеспечивающих осуществление реакции размножения, (д) регистрацию флуоресценции системы детекции, в том числе без разгерметизации контейнера, (е) анализ полученной информации, отличающийся тем, что до стадии (г) образец и водную среду иммобилизуют путем их заключения в водонерастворимый твердый матрикс с размером пор от 100 мкм до 5 нм, а гомогенная флуоресцентная система детекции включает хотя бы два хромофора, между которыми возможен перенос энергии, из которых хотя бы один (репортерный) хромофор является флуорогенным и связан в момент регистрации флуоресценции с продуктом размножения и/или с прилегающим к продукту размножения участком матрикса.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что водную среду иммобилизуют путем пропитывания ею достаточного количества сухого матрикса.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что образец смешивают с водной средой до ее иммобилизации.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют гелеобразный матрикс; образец приготавливают из клеток, отдельных или в составе фрагмента (фрагментов) ткани, которые внедряют в матрикс до стадии (а) путем введения в гелеобразующую смесь до формирования геля; а стадия (а) включает: (1) лизис внедренных в гель клеток, (2) промывание геля раствором, включающим смешиваемый с водой органический растворитель, в условиях, обеспечивающих преципитацию хотя бы одной нуклеиновой кислоты-мишени, и удаление лизирующих реагентов и других веществ, способных ингибировать размножение мишени, (3) высушивание геля.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что до лизиса внедренных в гель клеток выполняют следующие операции: (1) гель хотя бы частично высушивают; (2) гель пропитывают водным раствором, включающим гелеобразующий мономер и активируемый катализатор гелеобразования; (3) активируют катализатор.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что в раствор для пропитывания геля включают хотя бы одно вещество, увеличивающее проницаемость клеточной мембраны для мономера и катализатора.

7. Способ по п.4, отличающийся тем, что клетки вводят в гелеобразующую смесь, включающую гелеобразующий мономер, активируемый катализатор гелеобразования и хотя бы одно вещество, увеличивающее проницаемость клеточной мембраны для мономера и катализатора, и запускают процесс формирования геля путем активирования катализатора.

8. Способ по любому из пп.4-7, отличающийся тем, что используют реакционный контейнер, несущий на внутренней поверхности одной из сторон сухой регидратируемый гель А, размер пор которого обеспечивает при его набухании в процессе регидратации вытеснение клеток или фрагментов ткани к противолежащей плоской стороне контейнера, а скорость набухания и количество которого достаточны для существенно полного заполнения объема контейнера до формирования геля Б из указанной гелеобразующей смеси с образованием слитого геля.

9. Способ по любому из пп.4-7, отличающийся тем, что в гель внедряют хотя бы один внутренний стандарт, представляющий собой калибровочную частицу, с которой обратимо связано известное число молекул нуклеиново-кислотной матрицы, размножаемой присутствующей в геле системой размножения с образованием продуктов, детектируемых присутствующей в геле системой детекции.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что используют внутренний стандарт, включающий матрицу, отличающуюся от мишени, но размножаемую с эффективностью, близкой к эффективности размножения мишени, а в систему детекции вводят зонд, специфичный к матрице, связанной с внутренним стандартом.

11. Способ по п.9, отличающийся тем, что используют внутренний стандарт, включающий матрицу, идентичную мишени, но при этом знают местоположение в матриксе хотя бы одной калибровочной частицы.

12. Способ по любому из пп.4-7, отличающийся тем, что клетки лизируют с использованием лизирующего раствора, включающего соль гуанидина или соль додецилсульфата.

13. Способ по любому из пп.4-7, отличающийся тем, что в раствор, которым промывают гель после лизиса клеток, включают соль, растворимую в условиях промывания геля.

14. Способ по любому из пп.4-7, отличающийся тем, что перед высушиванием гель вымачивают в растворе, фиксирующем клетки.

15. Способ по любому из пп.4-7, отличающийся тем, что гель высушивают под вакуумом.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что гель высушивают в замороженном состоянии.

17. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что матрикс выбирают из группы веществ, включающей полиакриламид, аналоги полиакриламида или производные таковых.

18. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что матрикс модифицируют положительно заряженными группами.

19. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что хотя бы один из праймеров системы размножения ковалентно иммобилизуют на матриксе.

20. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что для размножения хотя бы одной из мишеней осуществляют обратную транскрипцию.

21. Способ по п.20, отличающийся тем, что в систему размножения включают фермент, обладающий обратнотранскриптазной активностью.

22. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что используют изотермическую систему размножения.

23. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что в качестве системы размножения используют систему ПЦР.

24. Способ по п.23, отличающийся тем, что используют систему асимметричной ПЦР.

25. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что используют гомогенную флуоресцентную систему детекции, включающую флуорогенный краситель нуклеиновых кислот.

26. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что используют гомогенную флуоресцентную систему детекции, включающую для каждого из мишень-специфичных продуктов размножения хотя бы один флуоресцентно меченный зонд, флуоресценция которого зависит от его гибридизации с продуктом размножения.

27. Способ по п.26, отличающийся тем, что для детекции хотя бы одного мишень-специфичного продукта размножения в систему детекции включают два гибридизующихся рядом FRET-зонда, включающих донорный флуорофор и акцепторный флуорофор, и на стадии (д) используют процедуру, включающую возбуждение донора и регистрацию излучения акцептора.

28. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что используют гомогенную флуоресцентную систему детекции, включающую флуорогенный краситель нуклеиновых кислот, а также для каждого из мишень-специфичных продуктов размножения хотя бы один зонд, меченый флуорофором, способным в отношении красителя служить акцептором или донором энергии в процессе FRET, и на стадии (д) используют процедуру, включающую возбуждение донора и регистрацию излучения акцептора.

29. Способ по п.26, отличающийся тем, что для детекции хотя бы одного специфического продукта размножения в систему детекции включают зонд, включающий флуоресцентный репортер и его гаситель, находящиеся достаточно близко друг от друга для эффективного переноса энергии между ними, и устроенный таким образом, что гибридизация зонда со специфическим продуктом размножения приводит к увеличению расстояния между гасителем и репортером.

30. Способ по п.29, отличающийся тем, что в качестве зонда используют однотяжный молекулярный бакен.

31. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что для детекции хотя бы одной размножаемой мишени используют зонд, включающий флуоресцентный репортер и его гаситель, находящиеся достаточно близко друг от друга для эффективного переноса энергии между ними и разделенные хотя бы одной межнуклеотидной связью, гидролизуемой включенной в систему размножения обладающей 5′→3′-экзонуклеазной активностью ДНК-полимеразой, копирующей ту же молекулу мишени, с которой гибридизован зонд, причем репортерную часть зонда иммобилизуют на матриксе.

32. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что в водную среду включают хотя бы один флуоресцентно меченный мишень-специфичный праймер, являющийся компонентом системы размножения и одновременно компонентом системы детекции, флуоресценция которого зависит от его включения в продукт размножения.

33. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что в систему размножения включают праймеры для синтеза хотя бы двух мишень-зависимых продуктов, а в гомогенную систему детекции включают флуоресцентные зонды и/или праймеры, специфичные к этим мишеням.

34. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что регистрацию флуоресценции осуществляют неоднократно в процессе стадии (г).

35. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что регистрация флуоресценции включает измерение кривой плавления для хотя бы одного специфического продукта размножения.

36. Устройство для размещения клеток существенно в одной плоскости, а также для размножения существенно в одной плоскости и бесконтактной детекции продуктов размножения нуклеиновых кислот с помощью флуоресценции, изготовленное из материала, устойчивого к условиям размножения и детекции; включающее хотя бы одну герметизируемую реакционную камеру (контейнер), включающую смотровую сторону, хотя бы часть которой прозрачна в области спектра, используемой для регистрации флуоресценции, и противолежащее основание, и оснащенную хотя бы двумя закрываемыми противолежащими отверстиями, пригодными для ввода в камеру жидкости и выхода из камеры вытесняемого воздуха, отличающееся тем, что камера имеет толщину (расстояние между смотровой стороной и основанием) от 1 мкм до 1 мм, по крайней мере, в 10 раз меньшую, чем наибольшее из измерений основания и смотровой стороны; одна из указанных сторон камеры несет на внутренней поверхности регидратируемый сухой гель, который способен набухать при впитывании жидкой среды, вводимой через одно из отверстий; химические и физические свойства которого в набухшем состоянии совместимы с условиями реакции размножения и детекции; и который не переходит в золь в этих условиях.

37. Устройство по п.36, отличающееся тем, что реакционная камера имеет плоские смотровую сторону и основание, наименьшее из измерений которых, по крайней мере, в 10 раз больше толщины камеры.

38. Устройство по п.36, отличающееся тем, что реакционная камера имеет удлиненную (палочковидную, капиллярную) форму.

39. Устройство по п.38, отличающееся тем, что реакционная камера, имеющая удлиненную (палочковидную, капиллярную) форму, является деформируемой с возможностью придания ей непалочковидной конфигурации.

40. Устройство по п.36, отличающееся тем, что сухой матрикс геля зафиксирован на внутренней поверхности камеры.

41. Устройство по любому из пп.36-40, отличающееся тем, что сухой матрикс геля выбирают из группы веществ, включающей полиакриламид, аналоги полиакриламида или производные таковых.

42. Устройство по любому из пп.36-40, отличающееся тем, что сухой матрикс геля модифицирован положительно заряженными группами.

43. Устройство по любому из пп.36-40, отличающееся тем, что сухой матрикс геля включает хотя бы один ковалентно связанный олигонуклеотид.

44. Устройство по п.43, отличающееся тем, что хотя бы один ковалентно связанный с матриксом олигонуклеотид флуоресцентно мечен.

45. Устройство по любому из пп.36-40, отличающееся тем, что способность к набуханию, количество и форма сухого матрикса геля таковы, что он способен впитать весь объем жидкой реакционной среды, необходимый для заполнения камеры, и заполнить при этом весь внутренний объем камеры.

46. Устройство по любому из пп.36-40, отличающееся тем, что камеру собирают из, по крайней мере, двух частей, одна из которых включает смотровую сторону, а другая включает основание.

47. Способ размещения в слое геля, существенно в одной плоскости, клеток и/или иных микроскопических частиц, наименьший размер которых существенно меньше толщины слоя геля, включающий введение указанных частиц в водную гелеобразующую смесь, отличающийся тем, что гелеобразующей смесью заполняют контейнер, несущий на внутренней поверхности одной из сторон сухой регидратируемый гель А, размер пор которого обеспечивает при его набухании в процессе регидратации вытеснение указанных частиц к противолежащей плоской стороне контейнера, а скорость набухания и количество которого достаточны для существенно полного заполнения объема контейнера до формирования геля Б из указанной гелеобразующей смеси с образованием слитого геля.

48. Способ по п.47, отличающийся тем, что в гель вводят такое количество частиц, которое обеспечивает их плотную упаковку в виде монослоя у поверхности слитого геля.

49. Способ по любому из пп.47-48, отличающийся тем, что в качестве частиц используют живые клетки.

50. Способ по п.49, отличающийся тем, что внедренные клетки лизируют в геле с целью высвобождения клеточных компонентов.

51. Способ по п.50, отличающийся тем, что после лизиса гель промывают раствором, включающим смешиваемый с водой органический растворитель, в условиях, обеспечивающих преципитацию нуклеиновых кислот и удаление лизирующих реагентов, после чего матрикс геля высушивают.

52. Способ по п.51, отличающийся тем, что дополнительно высушенный гель пропитывают раствором, включающим бесклеточную ферментную систему экспоненциального размножения нуклеиновых кислот, способную размножать хотя бы один вид нуклеиновых кислот, содержащийся хотя бы в одной из внедренных в гель клеток, и инкубируют гель в условиях, обеспечивающих осуществление реакции размножения.

53. Способ по любому из пп.50-52, отличающийся тем, что осуществляют анализ содержащихся в геле нуклеиновых кислот.

54. Способ по п.53, отличающийся тем, что анализ включает идентификацию и/или обнаружение изменений в нуклеотидной последовательности хотя бы одного вида нуклеиновых кислот.

55. Продукт любого из способов по пп.47-51.