ШТАММ БАКТЕРИЙ SALMONELLA ENTERIDITIS E-23 BMC120 ДЛЯ ИММУНИЗАЦИИ ПРОТИВ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2002 года по МПК A61K39/12 A61K39/112 C12N1/21 C12N1/21 C12R1/42 

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано для создания иммунитета против вируса иммунодефицита человека.

Известен штамм бактерий Salmonella typhimurium SL 7207, см. "Induction of mucosal and systematic responses against human immunodeficiency virus type 1 glycoprotein 120 in mice after oral immunisation with a single dose of a Salmonella-HIV vector", Shaoguuang Wu, D.B.Pascual, G.K.Lewis, D.M. Hone, 1997, AIDS Research and Human Retroviruses, vol. 13, no 14, pp. 1187-1193 (копия ссылки прилагается). Штамм вводили мышам per os. В результате у мышей индуцировали выраженный иммунный ответ к вирусному белку gp 120 вируса иммунодефицита человека; клетки сальмонелл секретируют данный вирусный белок в периплазму бактериальных клеток; наблюдается пролиферативный ответ спленоцитов иммунизированных мышей на 14 сутки после иммунизации per os; в основном индуцировались Th 1 и Th 2-ответы, а также отмечена индукция IgA-секретирующих клеток в lamina propria и в мезентерических лимфоузлах.

Однако следует отметить, что в данном аналоге существенным недостатком является то, что белок, синтезируемый бактериальной клеткой, не гликозилируется, вследствие чего не вызывает полноценный иммунный ответ.

Известен также штамм бактерий Salmonella typhimurium SL 7207 (aro A his G 46), содержащий эукариотические вектора, экспрессирующие два укороченных белка (Act А и листериолизин) патогенной бактерии Listeria monocytogenes, см. "Oral somatic transgene vaccination using attenuated S.typhimurium", A. Darji, C. A.Gusman, B.Girstel, P.Wachholz, K.N.Timmis, J.Wehland, T.Chakraborty, S.Weiss, 1997, Cell vol. 91, pp. 765-775 (копия ссылки прилагается). Мышей иммунизировали per os. Наблюдали образование цитотоксических лимфоцитов, Т-хелперных клеток и антител к данным белкам у иммунизированных таким образом животных, а также их невосприимчивость к внутривенному введению Listeria monocytogenes в дозе 10•LD₅₀.

Недостатком этого штамма является отсутствие способности вызывать иммунный ответ в отношении вируса иммунодефицита человека.

Известен штамм бактерий Salmonella typhimurium SL 3621, см. "Potential live vaccines for HIV", M.S.Burnett, N.Wang, M.Hofmann, G.B.Kitto, Vaccine (2001) vol. 19, pp. 735-742 (копия ссылки прилагается). Эти бактерии синтезируют белок Pol вируса иммунодефицита человека в виде слитного белка, Pol-OmpA. Мышей иммунизировали per os. После иммунизации мышей клетками данных бактерий наблюдается появление специфического иммуноглобулина А к целевому белку в экстактах фекалий, появление пролиферативного клеточного ответа, а также индукция цитотоксических лимфоцитов селезенки к клеткам, представляющим собой фрагменты полимеразы.

Данное техническое решение принято в качестве пропотипа настоящего изобретения.

Его недостатком является то обстоятельство, что этот штамм не индуцирует антитела к поверхностному белку gp 120 вируса иммунодефицита человека. Вследствие этого не возникает антител, реагирующих с поверхностью вирусных частиц, что обусловливает недостаточную иммунизацию организма к вирусу иммунодефицита человека.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма бактерий, способных вызвать эффективную иммунизацию организма в отношении вируса иммунодефицита человека.

Для решения указанной задачи предлагается штамм бактерий Salmonella enteriditis E-23 BMC120, обладающий высокой способностью вызывать выраженную и действенную иммунизацию к вирусу иммунодефицита человека.

Штамм бактерий Salmonella enteriditis E-23 BMC120 получен из штамма Salmonella enteriditis E-23 (cya), являющегося модификацией штамма дикого типа Salmonella enteriditis 1791, выделенного из природных источников.

Получение штамма Salmonella enteriditis E-23 BMC120 происходило при помощи введения в штамм Salmonella enteriditis E-23 плазмиды рВМС-120, обеспечивающей синтез белка gp 120 вируса иммунодефицита человека в клетках млекопитающих и несущей также ген устойчивости к ампициллину; в результате получен штамм Salmonella enteriditis E-23 BMC120.

Этот штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под номером ВНИИСХМ 423-Д от 16.07.2001. Идентификация штамма проведена по "Определителю бактерий Берги"; М., 1997.

Культурально-морфологические признаки штамма:
Морфология: грамотрицательные палочки, средних размеров, расположены хаотично.

Культуральные свойства: растет на мясо-пептонном агаре, глюкозоминимальном агаре Дэвиса, средах Мак-Конки, Левина, Эндо, Кауфмана, колонии в S-форме мелких размеров через 18 часов роста при 37^oС. В мясо-пептонном бульоне, желчном бульоне, жидкой глюкозоминимальной среде А (Дэвиса) - диффузное помутнение через 18 часов роста. В цитратминимальной среде (Дэвиса) - отсутствие роста.

Резистентность к антибиотикам: на всех вышеперечисленных средах растет в присутствии ампициллина (100 мкг/мл).

Антигенная структура штамма:
O_9,12 H_G,M
Биохимические свойства штамма:
Продуцирует сероводород, обладает лизиндекарбоксидазной, орнитиндекарбоксилазной, аргининдегидрогеназной активностями, не продуцирует индол, не разжижает желатину, не гидролизует мочевину. Не утилизирует цитрат на агаре Симмонса.

Ферментирует глюкозу, сорбит, маннит, арабинозу, дульцит, трегалозу. Не утилизирует сахарозу, лактозу, мальтозу, инозит, адонит, эскулин, в течение 48-72 часов утилизирует рамнозу.

Вирулентность штамма.

Лабораторные мыши белые, беспородные, 12-14 гр. ЛД₅₀=10⁷ КОЕ (колониеобразующих единиц) после внутрибрюшинного заражения.

Чувствительность штаммов к бактериофагам.

Чувствителен к бактериофагу Р₂₂.

Плазмидный профиль.

Плазмида с молекулярной массой 55 кД и плазмида рВМС-120 с молекулярной массой 4,8 мД, экспрессирующая в эукариотических клетках синтез белка gpl20 вируса иммунодефицита человека.

Пример 1.

Готовили жидкую питательную среду: Пептон 10 г/л, Дрожжевой экстракт 5 г/л, натрий хлористый 10 г/л, к которой после автоклавирования добавляли ампициллин до конечной концентрации 100 мкг/мл. 100 мл вышеуказанной среды помещали в колбу объемом 1 л, после чего засевали материалом из одной колонии, выросшей на агаризованной плотной питательной среде такого же состава. Колбу инкубировали в качалке при температуре 37^oС и 250 об/мин в течение 18 часов, после чего определяли количество бактерий в одном миллилитре, оказавшееся равным 2•10⁸.

Бактерии концентрировали в 10 раз при помощи центрифугирования, после чего вводили per os мышам линии BALB/C по 1•10⁸ клеток/мышь. Через 14 дней иммунизацию мышей повторяли, еще через 7 дней животных забивали, выделяли спленоциты, которые смешивали с сингенными клетками-мишенями, экспрессирующими поверхностный белок вируса иммунодефицита человека. После совместной инкубации в течение 5 часов распад клеток-мишеней определяли известным способом. Результаты представлены в таблице 1.

Таким образом, иммунизация мышей штаммом Salmonella enteriditis E23 ВМС120 приводит к появлению спленоцитов, лизирующих клетки мыши, экспрессирующие белок env вируса иммунодефицита человека.

Пример 2.

Для иммунизации были использованы мыши линии BALB/C массой 12 г. Животным вводили перорально или перректально суспензию клеток рекомбинантной сальмонеллы, содержащих плазмиду, по 10⁹ живых клеток на каждую мышь на одну иммунизацию. Животных иммунизировали дважды: в день 0 и на 14-е сутки после первой иммунизации. В качестве отрицательного контроля использовали исходный штамм Salmonella typhimurium E-23, не обладающий способностью вызывать иммунный ответ к вирусу иммунодефицита человека. Оценку пролиферативного клеточного ответа спленоцитов животных проводили известным методом и выражали в виде индекса пролиферации. Результаты представлены в таблице 2.

(Salmonella enteriditis E-23 - контрольный штамм, не обладающий способностью вызывать иммунный ответ к вирусу иммунодефицита человека).

Как видно из таблицы 2, спленоциты животных, иммунизированных Salmonella enteriditis E-23 BMC120 ректально или перорально, сохраняют способность к пролиферации при добавлении лизата вируса иммунодефицита человека вплоть до 12 недель после первой иммунизации.

Пример 3.

Лабораторных мышей линии BALB/C весом 14-16 граммов иммунизировали перорально и перректально суспензией клеток Salmonella enteriditis E-23 BMC120 и контрольным штаммом Salmonella enteriditis E-23, по 10⁸ клеток на мышь, после чего в сроки, указанные в таблице, определяли титры антител к очищенному лизату вируса иммунодефицита человека в сыворотках крови иммунизированных животных. Результаты представлены в таблице 3.

Как видно из таблицы, иммунизация мышей Salmonella enteriditis E-23 BMC120 вызывает образование антител к вирусу иммунодефицита человека.

Изобретение относится к иммунологии. Штамм Salmonella enteriditis E-23 BMC120 получен из штамма Salmonella enteriditis. При помощи генетической трансформации в исходный штамм введена плазмида рВМС120, обеспечивающая синтез белка gp120 вируса иммунодефицита человека. Штамм Salmonella enteriditis E-23 BMC120 обладает высокой способностью вызывать выраженную и действенную иммунизацию к вирусу иммунодефицита человека. Штамм используется для создания иммунитета против вируса иммунодефицита человека. 3 табл.

Штамм бактерий Salmonella enteriditis, депонированный во ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под номером "ВНИИСХМ 423-Д" для иммунизации против вируса иммунодефицита человека.