Способ стимуляции выработки эритропоэтина клетками костного мозга in vitro Российский патент 2020 года по МПК C12N5/00 C12N5/78 

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины, и касается способа стимуляции выработки эритропоэтина in vitro.

Существуют разные способы стимуляции выработки цитокинов, в том числе эритропоэтина, различными клетками костного мозга [1, 2].

Известен способ стимуляции выработки эритропоэтина неприлипающими клетками костного мозга in vitro с помощью ингибитора протеинкиназы р38, который добавляют в концентрации 300 мкМ в культуру ткани и инкубируют при 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов [3]. Данный способ является наиболее близким по технической сущности, механизму действия и достигаемому результату к заявляемому и выбран в качестве прототипа.

Недостатком данного способа является незначительная стимуляция выработки эритропоэтина.

Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение эффективности способа.

Поставленная задача достигается тем, что in vitro культивируют прилипающую фракцию клеток костного мозга в CO₂-инкубаторе при 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, при добавлении ингибиторов C-Jun N-terminal kinase (JNK) в эффективной концентрации.

Новым в предлагаемом изобретении является использование в качестве клеток костного мозга, вырабатывающих эритропоэтин, прилипающей фракции клеток костного мозга и использование в качестве стимулятора продукции эритропоэтина ингибитора JNK.

На сегодняшний день среди огромного разнообразия фармакологических веществ для стимуляции гемопоэза [1] наиболее широко используются эндогенные стимуляторы кроветворения (эритропоэтин и колониестимулирующие факторы), которые, связываясь со специфическими рецепторами, запускают многочисленные внутриклеточные сигнальные механизмы, участвующие в реализации ключевых функций клеток - дифференцировки, пролиферации, старения, опухолевой трансформации [4-8]. Выявленные ранее в НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга особенности внутриклеточного сигналинга в прогениторных клетках различных классов позволили предложить новое направление терапии в регенеративной медицине - «Стратегию фармакологической регуляции внутриклеточной сигнальной трансдукции в регенераторно-компетентных клетках» [8]. Данный подход предполагает селективное воздействие на отдельные сигнальные молекулы, играющие важную роль в реализации функций не только прогениторных клеток, но и элементов микроокружения тканей, опосредовано определяющих течение репаративных процессов. При этом исследование синтеза эритропоэтина клетками гемопоэзиндуцирующего микроокружения (ГИМ) в условиях in vitro представляет собой основу методологии разработки в рамках указанного направления таргентных гемостимуляторов с эритропоэзстимулирующей активностью [2].

Известен ряд сигнальных молекул, участвующих в реализации функций, в том числе секреторной активности, некоторых клеток костного мозга [8, 9]. Однако участие и роль C-Jun N-terminal kinase (JNK) в продукции эритропоэтина прилипающими клетками костного мозга до сих пор не известна.

Факт культивирования прилипающей фракции клеток костного мозга в условиях воздействия на них ингибиторов JNK с достижением нового технического результата, заключающегося в эффективной стимуляции выработки эритропоэтина in vitro, для специалиста является неочевидным. Эксперимент показал непредсказуемые результаты.

Новые свойства не вытекают явным образом из уровня техники в данной области. Идентичной совокупности признаков не обнаружено при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе.

Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Способ осуществляют следующим образом:

Взвесь клеток костного мозга мышей (5×10⁶ клеток/мл) разделяют на прилипающую и неприлипающую фракции. Полученные прилипающие клетки инкубируются в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, при добавлении ингибиторов JNK в эффективной концентрации (10-20 микромоль (мкМ)) в CO₂-инкубаторе при 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов. По окончании инкубации кондиционные среды после центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 минут собирают с помощью пипетки.

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах-самцах линии C57BI/6 в количестве 16 шт., массой 20-22 г. Животные получены из отдела экспериментальных биологических моделей НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ. Исследования проводили в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), Приказом МЗСР РФ №708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики».

Пример 1.

Суспензию костномозговых клеток, полученную в стерильных условиях (боксе, оборудованном ламинаром), инкубировали в течение 45 мин в среде RPMI-1640 ("Sigma", США), содержащей 10% ЭТС («Sigma», США), в 35 мм пластиковых чашках Петри («Corning», США) в течение 40-50 мин при 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности для выделения прилипающей фракции миелокариоцитов. После чего с помощью пипетки собирали и удаляли неприлипающие миелокариоциты, а прилипающие миелокариоциты в концентрации 2×10⁶ клеток/мл инкубировались в течение 24 часов в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640 («Sigma», США), 10% ЭТС («Sigma», США), 280 мг/л L-глутамина («Sigma», США), 50 мг/л гентамицина («Sigma», США), с добавлением 10 мкМ ингибитора JNK «SP600125» (InvivoGen», США), либо 20 мкМ ингибитора JNK «IQ-1S» (Tocris Bioscience, США), при 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности. Концентрации ингибиторов JNK «SP600125» в 10 мкМ и «IQ-1S» в 20 мкМ были отобраны в предварительных экспериментах в качестве наиболее эффективных.

Контролем служили культуры клеток без добавления ингибитора JNK и способ прототип [3]. Выработка эритропоэтина способа прототипа являлась критерием эффективности предлагаемого изобретения. По способу прототипу: полученные неприлипающие клетки (в концентрации 2×10⁶ клеток/мл) инкубировали в течение 24 часов в полной культуральной среде: 90% среды RPMI-1640 («Sigma», США), 10% ЭТС («Sigma», США), 280 мг/л L-глутамина («Sigma», США), 50 мг/л гентамицина («Sigma», США), с добавлением ингибитора протеинкиназы р38 «SB203580» (Calbiochem, США) в концентрации 300 мкМ, при 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности.

По окончании инкубации собирали кондиционные среды и определяли в них уровень эритропоэтина методом ИФА, с помощью набора фирмы «R&D Systems» (USA) согласно методическим указаниям производителя.

В ходе эксперимента показано, что добавление любого из используемых ингибиторов JNK в культуру прилипающих клеток костного мозга значительно повышало уровень содержания эритропоэтина в кондиционных средах. При этом увеличение данного параметра регистрировалось как в сравнении с таковым в кондиционных средах, полученных от прилипающих и неприлипающих клеток костного мозга без ингибиторов, так и при в отношении аналогичного показателя при добавлении в культуру неприлипающих миелокариоцитов ингибитора протеинкиназы р38 (по способу прототипу) (табл.).

Полученные результаты свидетельствуют о важной роли JNK-опосредованного сигналинга в регуляции секреторной функции стромальных элементов гемопоэзиндуцирующего микроокружения, в первую очередь резидентных макрофагов и моноцитов кроветворной ткани [1, 2]. При этом блокада JNK прилипающих клеток костного мозга в условиях in vitro сопровождалась выраженной стимуляцией продукции ими эритропоэтина.

Предлагаемый в качестве изобретения способ позволяет эффективно стимулировать выработку эритропоэтина клетками костного мозга in vitro.

Цитируемая литература:

1. Дыгай A.M., Жданов В.В., Удут Е.В. Фармакологическая регуляция эритропоэза. Москва, 2009.

2. Дыгай A.M., Жданов В.В., Гольдберг В.Е., Зюзьков Г.Н., Удут Е.В., Хричкова Т.Ю., Симанина Е.В., Мирошниченко Л.А., Ставрова Л.А. Методические рекомендации по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ // Руководство по проведению доклинических исследований новых лекарственных средств. Часть первая / Под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2013. - С. 759-766 (944 с).

3. Патент (RU) на изобретение №2589288 от 08.06.2016 г. Способ стимуляции выработки эритропоэтина в культуре клеток in vitro. Авторы: Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., Мирошниченко Л.А., Удут Е.В., Хричкова Т.Ю., Симанина Е.В., Шерстобоев Е.Ю., Агафонов В.И., Бурмина Я.В., Минакова М.Ю.

4. Дыгай A.M., Жданов В.В., Мирошниченко Л.А., Удут Е.В., Зюзьков Г.Н., Симанина Е.В., Чайковский А.В., Ставрова Л.А., Трофимова Е.С., Бурмина Я.В. Участие сигнальных каскадов в регуляции эритропоэза при цитостатическом воздействии // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2014. №9. С. 282-286.

5. Grimberg A. Mechanisms by which IGF-I may promote cancer. // Cancer Biol Ther, 2003, 2, P. 630-635.

6. Dygai A.M., Zhdanov V.V., Zyuzkov G.N., Udut E.V., Miroshnichenko L.A., Simanina E.V., Chaikovskii A.V., Stavrova L.A., Danilets M.G. Role of NF-κВ-dependent signaling and p38 mapk signaling pathway in the control of hemopoiesis during cytostatic administration // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2014. T. 157. №1. C. 32-36.

7. Зюзьков Г.Н., Жданов B.B., Удут E.B., Мирошниченко Л.А., Симанина Е.В., Полякова Т.Ю., Ставрова Л.А., Удут В.В., Минакова М.Ю., Дыгай A.M. Участие JAK1, JAK2 и JAK3 в стимуляции функций мезенхимных клеток-предшественников фактором роста фибробластов // Бюл. эксперим. биол. и медицины, 2016. - №8. - С. 206-209.

8. Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Удут Е.В., Мирошниченко Л.А., Полякова Т.Ю., Ставрова Л.А., Удут В.В. Стратегия фармакологической регуляции внутриклеточной сигнальной трансдукции в регенераторно-компетентных клетках // Бюл. эксперим. биол. и медицины, 2018. - №10. - С. 435-445.

9. Зюзьков Г.Н., Суслов Н.И., Поветьева Т.Н., Нестерова Ю.В., Удут Е.В., Мирошниченко Л.А., Полякова Т.Ю., Афанасьева О.Г., Жданов В.В. Механизмы церебропротекторного действия ингибитора C-Jun N-terminal kinase (JNK) // Экспериментальная и клиническая фармакология, 2017. - Том 80. - №6. - С. 14.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к стимуляции выработки эритропоэтина клетками костного мозга in vitro. Способ включает культивирование фракции прилипающих миелокариоцитов костного мозга в CO₂-инкубаторе при 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина с добавлением ингибитора JNK в эффективной концентрации. Изобретение позволяет повысить выработку эритропоэтина. 1 табл., 1 пр.

Способ стимуляции выработки эритропоэтина клетками костного мозга in vitro, заключающийся в том, что клетки костного мозга культивируют в CO₂-инкубаторе при 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина с добавлением стимулятора выработки эритропоэтина, отличающийся тем, что культивируют фракцию прилипающих миелокариоцитов костного мозга, а в качестве стимулятора выработки эритропоэтина используют ингибитор JNK в эффективной концентрации.