Способ стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора клетками костного мозга in vitro Российский патент 2018 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины и касается способа стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора in vitro.

Существуют разные способы стимуляции выработки цитокинов, в том числе гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, различными клетками костного мозга [1, 2].

Наиболее близким по технической сущности, механизму действия и техническому результату (прототипом) является способ стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора in vitro прилипающими клетками костного мозга in vitro с помощью ингибитора протеинкиназы р38, который добавляют в концентрации 300 мкМ в культуру ткани и инкубируют при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов [2].

Недостатком данного способа является недостаточная стимуляция выработки колониестимулирующего фактора под действием данного ингибитора.

Задачей, решаемой данным изобретением, является расширение арсенала способов стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора клетками костного мозга in vitro и повышение эффективности способа.

Поставленная задача достигается тем, что in vitro культивируют фракцию непри-липающих миелокариоцитов в СO₂-инкубаторе при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, при добавлении ингибитора фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) в концентрации 50 мкМ (микромоль).

Новым в предлагаемом изобретении является использование в качестве клеток костного мозга, вырабатывающих гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, неприлипающей фракции костного мозга и использование ингибитора PI3K в качестве стимулятора продукции гранулоцитарного колониестимулирующего фактора.

На сегодняшний день среди различных фармакологических средств, применяемых в качестве гемостимуляторов, наиболее широко используются препараты на основе эндогенных стимуляторов кроветворения (колониестимулирующие факторы и эритропоэтин), которые, связываясь со специфическими рецепторами, запускают многочисленные сигнальные механизмы, участвующие в реализации ключевых функций клеток [1, 3, 4]. Особого внимания заслуживает препарат гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) [3]. Исследование синтеза данного гемопоэтина клетками костного мозга - элементами гемопоэзиндуцирующего микроокружения, в системе in vitro является важным элементом методологии создания гемостимулирующих средств [4] с таргетным действием путем активации/ингибирования внутриклеточного сигналинга [5-8]. Указанные исследования проводятся в рамках нового направления таргетной терапии в регенеративной медицине, предложенного в НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга (Томский НИМЦ) - «Стратегии фармакологической регуляции внутриклеточной сигнальной трансдукции в регенераторно-компетентных клетках» [5]. В связи с этим разработка эффективных способов продукции гранулоцитарного колониестимулирующего фактора с помощью модификаторов активности внутриклеточного сигналинга представляется актуальной.

Известен ряд сигнальных молекул, участвующих в определении функциональной, в том числе секреторной, активности некоторых клеток костного мозга [1, 8]. Однако участие и роль фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) в продукции гранулоцитарного колониестимулирующего фактора неприлипающими клетками костного мозга до сих пор не изучены.

Факт использования неприлипающей фракции костного мозга при добавлении в культуральную среду ингибитора PI3K с достижением нового технического результата, заключающегося в эффективной стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора in vitro, для специалиста является неочевидным. Эксперимент показал непредсказуемые результаты.

Новые свойства не вытекают явным образом из уровня техники в данной области. Идентичной совокупности признаков не обнаружено при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе.

Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Способ осуществляют следующим образом.

Из клеток костного мозга получают неприлипающую фракцию клеток. Неприлипающие клетки костного мозга инкубируют в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 50 мкМ ингибитора PI3K, в СO₂-инкубаторе при 370С, 5% СO₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов. По окончании инкубации кондиционные среды после центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 минут собирают с помощью пипетки.

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах-самцах линии C57BI/6JY в количестве 14 шт., массой 20-22 г. Животные получены из отдела экспериментальных биологических моделей НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ. Исследования проводили в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), Приказом МЗСР РФ №708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики».

Пример 1.

Суспензию костномозговых клеток, полученную в стерильных условиях (боксе, оборудованном ламинаром), инкубировали в течение 45 мин в среде RPMI-1640 ("Sigma", США), содержащей 10% ЭТС («Sigma», США), в 90 мм пластиковых чашках Петри («Corning», США) диаметром 35 мм в течение 40-50 мин при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности для выделения неадгезирующей фракции миелокариоцитов. После чего с помощью пипетки собирали неприлипающие миелокариоциты, которые (в концентрации 2×10⁶ клеток/мл) инкубировались в течение 24 часов в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640 («Sigma», США), 10% ЭТС («Sigma», США), 280 мг/л L-глутамина («Sigma», США), 50 мг/л гентамицина («Sigma», США), 50 мкМ ингибитора PI3K («Calbiochem», США), при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности [4]. Используемая концентрация ингибитора PI3K была отобрана в предварительных экспериментах в качестве наиболее эффективной.

При этом контролем №1 и №2 служили кондиционные среды от неприлипающих и прилипающих клеток костного мозга (соответственно) без добавления ингибитора соответственно, а группой сравнения - кондиционные среды от прилипающих клеток костного мозга с добавлением ингибитора протеинкиназы р38, полученные по способу-прототипу.

Для получения прилипающих клеток костного мозга для контроля №2 и способа прототипа [2] суспензию костномозговых клеток, полученную в стерильных условиях (боксе, оборудованном ламинаром), инкубировали в течение 45 мин в среде RPMI-1640 ("Sigma", США), содержащей 10% ЭТС («Sigma», США), в 90 мм пластиковых чашках Петри («Corning», США) диаметром 35 мм в течение 40-50 мин при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности для выделения адгезирующей фракции миелокариоцитов. После чего с помощью пипетки собирали неприлипающие миелокариоциты, а прилипающие клетки инкубировались в течение 24 часов в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640 («Sigma», США), 10% ЭТС («Sigma», США), 280 мг/л L-глутамина («Sigma», США), 50 мг/л гентамицина («Sigma», США), 300 мкМ ингибитора протеинкиназы р38 («Calbiochem», США), при 37°С, 5% СO₂ и 100% влажности.

По окончании инкубации собирали кондиционные среды и определяли в них уровень Г-КСФ методом ИФА, с помощью набора фирмы «R&D systems» (USA) согласно методическим указаниям производителя.

В ходе эксперимента показано возрастание выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора лишь при добавлении стимулятора выработки к прилипающим клеткам костного мозга (способ-прототип) и при реализации заявляемого способа. Причем при добавлении ингибитора PI3K в культуру неприлипающих клеток костного мозга уровень выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора статистически значимо превосходил таковой способа прототипа (культивирование прилипающих клеток костного мозга с добавлением ингибитора р38) (табл. 1).

Таким образом, инкубация неприлипающей фракции клеток костного мозга с ингибитором PI3K приводит к наиболее значительной стимуляции выработки Г-КСФ in vitro.

Предлагаемый способ позволяет эффективно стимулировать выработку гранулоцитарного колониестимулирующего фактора неадгезирующими миелокариоцитами in vitro.

* - отмечена достоверность различий с показателями с таковым в 1-й группе (контроль №1) при р<0,05;

# - отмечена достоверность различий показателя с таковым во 2-й группе (контроль №2) при р<0,05;

$ - отмечена достоверность различий показателя между 3-й и 4-й группами при р<0,05.

Цитируемая литература:

1) Дыгай A.M., Жданов В.В., Мирошниченко Л.А., Удут Е.В., Зюзьков Г.Н., Симанина Е.В., Чайковский А.В., Ставрова Л.А., Трофимова Е.С., Бурмина Я.В. Участие сигнальных каскадов в регуляции эритропоэза при цитостатическом воздействии // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2014. №9. С. 282-286.

2) Патент (RU) на изобретение №2527888 от 14.06.2014 г. Способ стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора клетками костного мозга in vitro. Авторы: Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., Мирошниченко Л.А., Удут Е.В., Симанина Е.В., Ставрова Л.А., Чайковский А.В., Хричкова Т.Ю., Бурмина Я.В.

3) Дыгай A.M., Жданов В.В. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Фармакологические аспекты. Москва, 2009, с. 18-19.

4) Дыгай A.M., Жданов В.В., Гольдберг В.Е., Зюзьков Г.Н., Удут Е.В., Хричкова Т.Ю., Симанина Е.В., Мирошниченко Л.А., Ставрова Л.А. Методические рекомендации по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ // Руководство по проведению доклинических исследований новых лекарственных средств. Часть первая / Под ред. А.Н. Миронова. М.: Гриф и К, 2013. С. 759-766 (944 с.).

5) Патент (RU) на изобретение №2599289 «Средства, стимулирующие регенерацию тканей» (опубл. 10.10.2016, Бюл. №28). Авторы: Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Данилец М.Г., Мирошниченко Л.А., Удут Е.В., Дыгай A.M.

6) Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Данилец М.Г., Удут Е.В., Мирошниченко Л.А., Лигачева А.А., Симанина Е.В., Чайковский А.В., Трофимова Е.С., Минакова М.Ю., Удут В.В., Дыгай A.M. Участие цАМФ и IKK-2-зависимых сигнальных путей в реализации ростового потенциала мезенхимальных прогениторных клеток под влиянием основного фактора роста фибробластов // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2014. - Т. 157, №2. - С. 186-189.

7) Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Удут Е.В., Мирошниченко Л.А., Симанина Е.В., Полякова Т.Ю., Ставрова Л.А., Удут В.В., Минакова М.Ю., Дыгай A.M. Участие JAK1, JAK2 и JAK3 в стимуляции функций мезенхимных клеток-предшественников фактором роста фибробластов // Бюл. эксперим. биол. и медицины, 2016. №8. С. 206-209.

8) Dygai A.M., Zhdanov V.V., Zyuzkov G.N., Udut E.V., Miroshnichenko L.A., Simanina E.V., Chaikovskii A.V., Stavrova L.A., Danilets M.G. Role of NF-κB-dependent signaling and p38 mapk signaling pathway in the control of hemopoiesis during cytostatic administration // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2014. T. 157. №1. C. 32-36.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора клетками костного мозга in vitro, заключающийся в том, что клетки костного мозга культивируют в CO₂-инкубаторе при 37°C, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина с добавлением стимулятора, где культивируют неприлипающую фракцию клеток костного мозга, а в качестве стимулятора используют ингибитор PI3K в концентрации 50 мкМ. Предлагаемый способ позволяет эффективно стимулировать выработку гранулоцитарного колониестимулирующего фактора клетками костного мозга in vitro. 1 табл., 1 пр.

Способ стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора клетками костного мозга in vitro, заключающийся в том, что клетки костного мозга культивируют в CO₂-инкубаторе при 37°C, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина с добавлением стимулятора, отличающийся тем, что культивируют неприлипающую фракцию клеток костного мозга, а в качестве стимулятора используют ингибитор PI3K в концентрации 50 мкМ.