ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ПОВЫШЕННЫМ ОБРАЗОВАНИЕМ АНТИТЕЛ К НУКЛЕИНОВЫМ КИСЛОТАМ Российский патент 2010 года по МПК A61K31/712 A61P37/00 

Область изобретения

Изобретение относится к области медицины, в частности к области создания и применения средств для лечения аутоиммунных заболеваний.

Уровень техники

Аутоиммунные заболевания представляют большую проблему. В ряде случаев антитела образуются к нуклеиновым кислотам, в частности, к ДНК, как, например, при заболевании системная красная волчанка (СКВ). Однако даже при хронических инфекционных заболеваниях, например гепатит С, именно аутоиммунный ответ на ДНК является ведущим в поражении органов. Повышенный уровень антител к ДНК приводит к поражению суставов, сердечно-сосудистой системы, неврологическим расстройствам, обструктивному бронхиту.

Известны способы лечения СКВ, в которых используется гормонотерапия, а в тяжелых случаях - цитостатики. Однако способу присущи недостатки. Больные вынуждены постоянно принимать эти препараты, при этом глубокая супрессия иммунитета приводит к увеличению риска инфекций, поражению слизистой кишечника, дис- гормональным расстройствам (Сентякова Т.Н., 2003).

Прототипом изобретения является способ индукции толерантности к известному антигену, при котором антиген вводится энтерально. Индукция толерантности при этом происходит в пейеровых бляшках (Kagnoff MF., 1996). Известен способ предотвращения аутоиммунного диабета у мышей, при котором для формирования иммунологической толерантности к антигенам клеток Лангерганса; мышам вводили в питание гидролизат поджелудочной железы (A.Hanninen и L.С.Harrison, 2004). Данный феномен получил название энтеральной толерантности (oral tolerance). При этом формирующаяся толерантность не связана с тотальной иммуносупрессией, следовательно, отсутствует риск возникновения инфекционных осложнений. Однако методов лечения СКВ путем индукции иммунологической толерантности к ДНК в настоящее время нет. Одной из причин отсутствия клинически апробированных методов индукции энтеральной толерантности является сложность доставки антигена в нижние отделы кишечника без деградации этого антигена.

Технической задачей настоящего изобретения является создание способа лечения аутоиммунных заболеваний, связанных с повышенным образованием антител к ДНК на основе новой фармацевтической композиции для индукции энтеральной толерантности к нуклеиновым кислотам. Основная проблема, которой связаны известные разработки в данной области, состоит в использовании «чистой» ДНК, очищенной от связанных белков-нуклеопротеинов, а это приводит к быстрой деградации нуклеиновых кислот в желудочно-кишечном тракте.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение направлено на создание такой композиции, которая обеспечивает индукцию энтеральной толерантности, за счет сохранения стабильности антигена, ответственного за выработку антител к ДНК, предохраняя его от деградации в организме.

Указанный технический результат достигается предлагаемой фармацевтической композицией для индукции энтеральной толерантности к ДНК и лечения аутоиммунных заболеваний, за счет того, что она содержит в своем составе ДНК животного, бактериального, грибкового или растительного происхождения, или ее фрагменты, имеющие антигенные свойства, которые иммобилизированы на растворимом полимере.

За счет иммобилизации ДНК или олигонуклеотидов, входящих в состав композиции, обеспечивается их защита от деградации в организме, и в тоже время, они сохраняют свои антигенные свойства, позволяя организму вырабатывать иммунный ответ.

Вырабатываемый иммунный ответ, в том числе и образование антител к нуклеиновым кислотам, обеспечивает формирование толерантности к нативным ДНК.

Наличие иммуного ответа к нативным ДНК обеспечивает лечение заболеваний, связанных с повышенным образованием антител к нативной ДНК, т.е. для лечения аутоиммунных заболеваний, такими как системная красная волчанка, бронхиальная астма, васкулиты, ревматоидный артрит и др., для которых аутоиммунный ответ играет важную роль в этиопатогенезе.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение предлагает фармкомпозицию для индукции энтеральной толерантности к нативной ДНК и/или лечения аутоиммунных заболеваний, содержащую в качестве действующего вещества олигонуклеотиды животного, растительного, бактериального или грибкового происхождения, где олигонуклеотиды иммобилизованы на водорастворимом полимере.

В качестве действующего вещества, ответственного за выработку иммунитета, могут быть использованы полноразмерные ДНК или фрагменты, которые охватываются понятием олигонуклеотиды и которые проявляют антигенные свойства, необходимые для формирования иммунного ответа организма. ДНК или их фрагменты могут быть животного, бактериального, грибкового или растительного происхождения. Как правило, олигонуклеотиды, которые используются в композиции по изобретению, имеют молекулярную массу 1000-100000 Да. Возможно применение олигонуклеотидов с большей молекулярной массой, однако скорость и интенсивность иммунного ответа, скорее всего, будет снижена. Применение фрагментов нуклеиновых кислот с массой, меньшей чем 1000 Да, вызывает быстрый иммунный ответ, но не характеризующийся длительностью защитного действия. Варьируя массой олигонуклеотидов, можно добиваться желательного профиля иммунного ответа, описываемого в координатах "интенсивность ответа" - "длительность защитного действия".

Иммобилизация олигонуклеотидов в композиции осуществляется, в принципе, на любом водорастворимом полимере, применяемом в фармацевтической практике. Приемы иммобилизации олигонуклеотидов известны из уровня техники. Полученные иммобилизированные продукты должны сохранять способность растворяться в физиологических жидкостях организма.

В рамках изобретения в качестве полимеров могут использоваться различные физиологически и фармацевтически приемлемые водорастворимые полимеры. Их неограничивающий перечень включает такие полимеры, как полиэтиленоксиды (полиэтиленгликоли, карбовакс), крахмалы, декстраны, поливинилпирролидоны, сиаловые кислоты, изопренолы, акриламиды, поливинилацетаты, производные акриловой кислоты и т.п. Определяющим параметром при выборе полимера для композиции по изобретению служит условие растворимости полимера и полученного комплекса с иммобилизованными олигонуклеотидами. Как правило, молекулярная масса полимеров, способных растворяться в воде или физиологических жидкостях организма, не превышает 10000 Да.

В качестве одного из вариантов в рамках изобретения могут быть использованы полиэтиленгликоли с молекулярной массой 400-6000 Да. Для обеспечения иммобилизации олигонуклеотидов необходимо, чтобы полимер имел необходимые активные группы, обеспечивающие связывание с молекулами олигонуклеотидов. Такими группами могут быть, в частности, карбонильные группы.

Для создания таких высокоактивных групп в полимере может быть использован прием радиационной активации, в ходе которого исходный инертный полимер становится способным ко взаимодействию с олигонуклеотидами, обеспечивая их иммобилизацию. Однако следует иметь в виду, что активация водорастворимого полимера, т.е. придание ему способности связываться с олигонуклеотидами, может быть выполнена и другими способами уровня техники, например традиционными химическими способами.

В частном варианте осуществления изобретения может быть использован полиэтиленгликоль с молекулярной массой 400-6000 Да, который для активации подвергается воздействию радиационного излучения. В частности, 5-50%-ный водный раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой от 0,4 до 6 кДа подвергали воздействию тормозного излучения, генерируемого ускорителем ИЛУ-6 или ИЛУ-10 с энергией электронов 2,5 МэВ, поглощенная доза от 2 до 10 кГр, скорость набора дозы 1,65 кГр/час. Однако возможно использование и других видов ионизирующего излучения (гамма-излучение, лазерное, ультрафиолетовое излучение) (Gonchar A.M. и Auslender V.L. 1996; Gonchar A.M. и Auslender V.L., 1998, Vereschagin E.I., et al., 2001). Данные виды излучения обладают сходным эффектом на раствор полиэтиленгликоля, приводя к активации данного полимера.

Далее в раствор радиационно-активированного полиэтиленгликоля вводят фрагменты нуклеиновой кислоты до конечной концентрации 1-10 мг/мл. Смесь перемешивают в течение 10-30 минут до получения однородного прозрачного или слегка опалесцирующего раствора. В качестве активного компонента используют очищенные нуклеотиды животного или растительного происхождения молекулярной массой 1000-100000 Да.

Определяющим отличием заявляемой фармкомпозиции по сравнению с прототипом является то, что в качестве активного компонента используют не просто гидролизат тканей или выделенную ДНК, а нуклеотиды, иммобилизированные на радиационно-активированном водорастворимом полимере. При облучении в ходе радиационно-химического окисления полиэтиленгликоля, в полимере образуются высокоактивные карбонильные группы, за счет которых обеспечивается иммобилизация олигонуклеотидов.

Иммобилизация олигонуклеотидов на полимерных носителях, выбранных из числа водорастворимых полимеров, приводит к увеличению стабильности нуклеиновых кислот и росту биодоступности крупных биомолекул.

Таким образом, композиция по изобретению, благодаря своей уникальной конструкции, обеспечивает достижение заявленного технического результата.

Композиция по изобретению, в одном из частных вариантов выполнения, имеет следующий состав:

- ДНК животного, бактериального, грибкового или растительного происхождения, или ее фрагменты, молекулярной массой 1000-100000 Да;

- полиэтиленгликоль с молекулярной массой 400-6000 Да, подвергнутый радиационно-химическому окислению.

При этом соотношение компонентов (олигонуклеотиды и полимер) составляет от 1:20 до 1:3 по массе.

Для повышения эффективности композиции в нее могут быть добавлены протеиназы бактериального или животного происхождения. Доля протеиназ в композиции может составлять от 5 до 20% от общей массы композиции (по сухому веществу). Введение протеиназ в жидкую композицию уменьшает количество посторонних соединений, которые могут вызвать нежелательные реакции организма. Предпочтительным вариантом являются сериновые протеиназы, в частности - субтилизины.

Композиция, полученная в форме раствора, может быть высушена известными способами, применяемыми в области фармации.

Сухой продукт, полученный в результате высушивания, может быть использован для получения различных пероральных фармацевтических форм, таких как таблетки, капсулы, растворы, эмульсии и т.п.

Один из предпочтительных вариантов выполнения изобретения предполагает получение таблеток или капсул с гастроэнтерическим покрытием. Такая форма представления композиции способствует дополнительной защите композиции и более эффективной доставки ее в нижние отделы кишечника.

Способы и приемы получения лекарственных форм известны из уровня техники и не требуют детальных пояснений.

Эффективность предлагаемой фармкомпозиции в индукции энтеральной толерантности к нуклеиновым кислотам продемонстрирована в примере 1.

Пример 1

Предлагаемая фармкомпозиция использовалась у животных с индуцированным аутоиммунным ответом к нуклеиновым кислотам. Эксперименты проводились на самцах кроликов Шиншилла (масса тела 1,5-2 кг). Индукция осуществлялась ежедневной подкожной инъекцией очищенных нуклеотидов в дозе 10 мг подкожно совместно с адъювантом Фрейнда (0,2 мл) в течение 5 дней. Уровень антител к ДНК оценивался методом ИФА на 10, 20 и 30 день после первого введения.

В качестве первого контроля использовались животные, которым олигонуклеотиды энтерально не вводились. В качестве второго контроля использовались животные, которым вводились энтерально очищенные олигонуклеотиды, выделенные из молок лососевых рыб и неиммобилизованные на ПЭГ (25 мг/сутки). В опытных группах кроликам ежедневно внутрижелудочно вводилась ДНК лососевых рыб (фрагменты 1000-100000 Да), иммобилизованных на ПЭГ 1500 с помощью ионизирующего излучения в дозе 25 мг ДНК/сутки, однако во второй опытной группе вместе с ДНК вводились иммобилизированные на ПЭГ бактериальные протеиназы (субтилизины) в дозе 400 ПЕ/сутки.

Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 Влияние иммобилизованных на водорастворимом полимере олигонуклеотидов, вводимых энтерально, на развитие аутоиммунного ответа к нуклеиновым кислотам   Исходная концентрация антител к ДНК в крови Концентрация антител к ДНК в крови, 10 сутки после 1 введения Концентрация антител к ДНК в крови, 20 сутки после 1 введения Концентрация антител к ДНК в крови, 30 сутки после 1 введения Интактные 1,5+/-0,3 1,4+/-0,2 1,3+7-0,15 1,4+/-0,12 Контроль 1,4+/-0,2 11+/-1,3 12+/-0,3 12,5+/-0,2 Опыт неиммобилизованная ДНК 1,4+/-0,3 10+/-2,2 8+/-1,5 8,5+/-2,3 Опыт иммобилизованная ДНК без протеиназ 1,3+/-0,2 9,5+/-1,3 8,5+/-2,3 6,0+/-0,7 Опыт иммобилизованная ДНК с протеиназами 1,5+/-0,25 8,5+/-2,3 7+/-1,1 3,2+/-0,5*## * Р<0,05 по сравнению с соответствующим контролем, ## Р<0,05 по сравнению с опытом (неиммобилизированная ДНК)

Таким образом, энтеральное использование иммобилизованных на водорастворимых полимерах олигонуклеотидов сопровождается развитием иммунологической толерантности к нуклеиновым кислотам, быстрым угасанием образования антител к нуклеиновым кислотам и может быть использовано в терапии аутоиммунных заболеваний, связанных с образованием антител к нуклеиновым кислотам (системная красная волчанка, васкулиты, бронхиальная астма). Очевидно также, что введение в композицию иммобилизованных на полиэтиленоксиде протеиназ значительно увеличивает эффективность композиции в индукции иммунологической толерантности.

Пример 2

Предлагаемая фармкомпозиция использовалась у животных с индуцированным аутоиммунным ответом к нуклеиновым кислотам. Эксперименты проводились на самцах кроликов Шиншилла (масса тела 1,5-2 кг). Индукция осуществлялась ежедневной подкожной инъекцией очищенных нуклеотидов в дозе 10 мг подкожно совместно с адъювантом Фрейнда (0,2 мл) в течение 5 дней. Уровень антител к ДНК оценивался методом ИФА на 10, 20 и 30 день после первого введения.

В качестве первого контроля использовались животные, которым олигонуклеотиды энтерально не вводились. В качестве второго контроля использовались животные, которым вводились энтерально очищенные выделенные из бифидобактерий, фрагменты молекулярной массой 1000-100000 Да олигонуклеотиды, но неиммобилизованные на ПЭГ (25 мг/сутки). В опытных группах кроликам ежедневно внутрижелудочно вводились аналогичные бактериальные олигонуклеотиды, иммобилизованные на ПЭГ 400 с помощью ионизирующего гамма-излучения в дозе 25 мг нуклеиновых кислот/сутки.

Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 Влияние иммобилизованных на водорастворимом полимере бактериальных олигонуклеотидов, вводимых энтерально, на развитие аутоиммунного ответа к нуклеиновым кислотам   Исходная концентрация антител к ДНК в крови Концентрация антител к ДНК в крови, 10 сутки после 1 введения Концентрация антител к ДНК в крови, 20 сутки после 1 введения Концентрация антител к ДНК в крови, 30 сутки после 1 введения Интактные 1,5+/-0,1 1,4+/-0,3 1,3+/-0,15 1,4+/-0,5 Контроль 1,4+/-0,1 11,2+/-1,1 12+/-2,4 12,7+/-1,9 Опыт неиммобилизованная ДНК 1,4+/-0,25 9+/-2,1 8,5+7-1,7 8,1+/-1,9 Опыт иммобилизованная ДНК 1,5+/-0,3 9,3+/-2/2 8,1+/-1,7 5,0+/-0,5*## * Р<0,05 по сравнению с соответствующим контролем, ## Р<0,05 по сравнению с опытом (неиммобилизированная ДНК)

Таким образом, иммобилизованные на ПЭГ 400 бактериальные олигонуклеотиды молекулярной массой 1000-100000 Да также способны индуцировать энтеральную толерантность и снизить титр антител к нативной ДНК.

Пример 3

Больная К., возраст 56 лет, больна системной красной волчанкой, 24 года. Болезнь сопровождается поражением кожи, артрозом тазобедренных и коленных суставов, периодически возникающими васкулитами. Уровень антител к нативной ДНК до приема предлагаемой фармкомпозиции 6,52 ОЕ (норма до 1,2). Предлагаемая фармкомпозиция использовалась как биологически активная добавка к пище в суммарной суточной дозе 25 мг иммобилизованных на ПЭГ ДНК и 400 ПЕ иммобилизированных на ПЭГ субтиллизинов. Через 14 дней после начала приема предлагаемой фармкомпозиции уровень антител снизился на 40% по сравнению с исходным. Исчезли кожные проявления болезни, суставные боли, явления васкулита. Ремиссия стойкая. Еще через 14 дней на фоне продолжающегося приема отмечено дальнейшее снижение уровня антител еще на 30%, значительное улучшение самочувствия. При продолжении приема фармкомпозиции отмечено дальнейшее снижение титра антител к нативной ДНК. Данные представлены в таблице 3.

Таблица 3 Уровень антител к нативной ДНК в сыворотке крови больной системной красной волчанкой при приеме предлагаемой композиции   Исходные значения (ОЕ) 14 сутки 28 сутки 42 сутки Уровень атител к нативной ДНК в сыворотке крови 6,52 3,91 2,75 1,92

Таким образом, использование предлагаемой фармкомпозиции оказалось эффективным у больных с системной красной волчанкой, клиническое улучшение сочеталось со снижением титра антител к нативной ДНК.

Заявляемая фармкомпозиция может быть использована как самостоятельный метод лечения больных с такими аутоиммунными патологиями, как системная красная волчанка, а также бронхиальная астма, васкулиты, ревматоидный артрит, т.е. аутоиммунных заболеваний, связанных с повышенным образованием антител к нативной ДНК.

Вышеприведенные примеры выполняют иллюстративные функции и не предназначены для ограничения объема притязаний. Объем притязаний настоящего изобретения определяется только формулой, а описательная часть предназначается исключительно для пояснения сути изобретения. Варианты выполнения изобретения, в свете вышеприведенного раскрытия сущности изобретения и иллюстративных примеров, очевидны для специалистов и могут быть реализованы без дополнительного экспериментирования, используя исключительно методики и приемы, описанные в уровне техники.

Источники информации

1. Сентякова Т.Н. Системная красная волчанка. Новосибирск, 2003, с.192.

2. Kagnoff MF. 1996 Oral tolerance: mechanisms and possible role in inflammatory joint diseases. Baillieres Clin Rheumatol. 1996 Feb; 10(1):41-54.

3. A.Hanninen, L.C.Harrison Rev Diabet Stud. 2004 Fall; 1(3): 113-121. Mucosal Tolerance to Prevent Type 1 Diabetes: Can the Outcome Be Improved in Humans?

4. Gonchar A.M. and Auslender V.L. Immobilization of bacterial proteases on water-solved polymer by means of electron beam. Rad. Phys. Chem. 48 (1996), 795-797.

5. Gonchar A.M. and Auslender V.L. Electron beam immobilization of hydrolytic ferments having polyfunctional application. Rad. Phys. Chem. 52 (1998), 213-216.

6. E.I.Vereschagin, Do-Hung Khan, A.V.Troitskiy, O.V. Grishin, S.E. Petrov, E.P. Gulayeva, L.A. Bogdanova, M.V. Korobeinikov, V.L. Auslender. Radiation Technology in the Preparation of Polyethylene Oxide Hydrophilic Gels and Immobilization of Proteases for Use in Medical Practice. Arch. Pharm. Res. 2001. V. 24, No3. P..229-233.

Изобретение относится к фармакологии, медицине и биохимии. Предложена фармацевтическая композиция, индуцирующая энтеральную толерантность к нативной ДНК. Композиция содержит в качестве действующего вещества олигонуклеотиды, иммобилизованные на водорастворимом полимере путем облучения ионизирующим излучением водного раствора полимера. Заявленная композиция используется для лечения аутоиммунных заболеваний. Изобретение обеспечивает сохранение стабильности антигена, ответственного за выработку антител к ДНК, и предохраняя его от деградации в организме. 4 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Фармацевтическая композиция для лечения аутоиммунных заболеваний, связанных с повышенным образованием антител к ДНК, путем индукции энтеральной толерантности к нативной ДНК, содержащая в качестве действующего вещества олигонуклеотиды ДНК животного или бактериального происхождения, иммобилизованные на водорастворимом полимере, выбранном из группы: полиэтиленоксид, крахмал, декстран, поливинилпирролидон, сиаловые кислоты, изопренол, акриламид, поливинилацетат, производные акриловой кислоты, путем смешивания указанных олигонуклеотидов с облученным ионизирующим излучением водным раствором указанного полимера.

2. Композиция по п.1, дополнительно содержащая иммобилизованные бактериальные сериновые протеиназы (субтиллизины).

3. Композиция по п.1, где указанные олигонуклеотиды имеют молекулярную массу 1000-100000 Да, а ионизирующее излучение является гамма-излучением, или электронно-лучевым излучением, или лазерным излучением, или ультрафиолетовым излучением.

4. Композиция по п.1, содержащая указанные олигонуклеотиды с молекулярной массой 1000-100000 Да и полиэтиленгликоль с молекулярной массой 400-6000 Да в соотношении от 1:20 до 1:3.

5. Композиция по п.3, содержащая 5-20 мас.% указанных олигонуклеотидов с молекулярной массой 1000-100000 Да, 60-90 мас.% полиэтиленгликоля с молекулярной массой 400-6000 Да и 5-20 мас.% протеиназ бактериального происхождения.

6. Композиция по любому из пп.1-5, представленная в виде капсул или таблеток с гастроэнтерическим покрытием.