СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ПАТОГЕННОСТИ ШТАММА КОКСАКИ В ВИРУСА Российский патент 2010 года по МПК C12Q1/70 C12N7/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к определению степени патогенности энтеровирусных штаммов Коксаки В вируса, и может быть использовано для прогнозирования возможности эпидемий.

Известен способ иммунологической экспресс-диагностики энтеровирусных инфекций (патент РФ №2034025, C12N 5/00, G01N 33/555, 30.04.1995). Способ включает смешивание выявленных антигенов, содержащихся в исследуемом материале, со специфическими антителами и комплементом, добавление смеси бараньих эритроцитов, учет степени лизиса эритроцитов спектрофотометрически по цветовому показателю в зависимости от уровня освободившейся из эритроцитов каталазы.

Недостаток способа заключается в том, что он позволяет только диагностировать наличие вируса Коксаки В и не позволяет сделать прогноз степени его патогенности.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения патогенности энтеровирусных штаммов, выделенных от детей, больных различными формами нейроинфекций (патент РФ №2181886, G01N 33/48, C12Q 1/70, G01N 33/53, 27.04.2002 г.). В способе используют одно из свойств патогенности энтеровирусов: способность к продукции интерферона. В соответствии со способом изучают способность штаммов продуцировать различные типы интерферонов в клетках-продуцентах в сочетании с температурной чувствительностью, при этом исследуют продукцию интерферона энтероизоляторов непосредственно от больных, т.е. первично выделенные изоляты. Используют маркеры Ret 40 и Rct 28. По совокупности признаков: по превалированию репродукции вируса при 40°C по сравнению с 28°C и по 8-16-кратному увеличению синтеза альфа-интерферона над гамма-интерфероном считают выделенный штамм патогенным.

Способ позволяет дифференцировать штаммы исследуемых вирусов, в том числе и штамм Коксаки В вируса, по степени патогенности: спородические случаи заболевания или эпидемические.

Недостаток известного способа заключается в сложности выполнения.

Предлагаемый способ определения степени патогенности штамма Коксаки В вируса решает задачу создания соответствующего способа, осуществление которого позволяет достичь технического результата, заключающегося в упрощении способа.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе определения степени патогенности штамма Коксаки В вируса, включающем исследование штамма Коксаки В вируса, полученного непосредственно от больного, - полевой штамм и определение степени патогенности полевого штамма по результатам исследования, новым является то, что исследуют нейропатогенность полевого штамма Коксаки В вируса, при этом исследования проводят в условиях одного гнезда линейных мышей одного помета в возрасте от 2 до 4 дней с маткой, для чего мышей делят на две группы, одну из которых подвергают искусственному инфицированию полевым штаммом Коксаки В вируса, после чего выполняют исследования нейропатогенности полевого штамма у мышей, зараженных естественным путем, для чего фиксируют выраженные признаки поражений центральной нервной системы и сравнивают их характер с выраженными признаками поражений центральной нервной системы, характерными для взятых в качестве контрольных штаммов вируса Коксаки В, при этом в качестве контрольных берут известные штаммы - прототипный и эпидемический Коксаки В вирусов, после чего по результатам сравнения делают вывод о степени патогенности полевого штамма Коксаки В вируса, а именно при совпадении характера выраженных признаков поражений центральной нервной системы с признаками, характерными для прототипного и эпидемического штаммов Коксаки В, констатируют, что степень патогенности полевого штамма Коксаки В соответствует эпидемической, в противном случае констатируют, что степень патогенности полевого штамма Коксаки В соответствует межэпидемической.

Технический результат достигается следующим образом. Исследование для определения степени патогенности штамма Коксаки В вируса, полученного непосредственно от больного (полевой штамм), а не очищенного энтеровируса, например ТС-мутанты (Ret 28) дикого вируса Коксаки В₃ и др., обеспечивает достоверность полученных результатов, а следовательно, возможность реализации способа и достижение заявленного технического результата.

Упрощение по сравнению с прототипом заявленного способа определения степени патогенности штамма Коксаки В вируса обеспечивается благодаря тому, что в заявленном способе для определения степени патогенности штамма исследуют только нейропатогенность полевого штамма Коксаки В вируса в сравнении с известными уже описанными штаммами: прототипным и эпидемическим. Возможность этого обуславливается следующим.

Авторами были выполнены многочисленные исследования по изучению степени поражения центральной нервной системы вирусами Коксаки В, а также дана оценка нейропатогенных свойств Коксаки В вирусов, выделенных в разные годы. Авторы доказали, что в результате заражения Коксаки В вирусом всегда поражается центральная нервная система (В.К.Слабоденюк, Ю.В.Григорьева и др. «Оценка нейропатогенных свойств Коксаки В вирусов, выделенных в разные годы», Уральский медицинский журнал, спецвыпуск «Микробиология», ноябрь 2008 г., с.36…40). На основании этого в заявленном способе авторами предложено использовать это свойство вируса Коксаки В для определения степени его патогенности, используя в качестве критерия только наличие выраженных признаков поражения центральной нервной системы - как визуальных (парезы, тремор, расстройство координации движений), так и результатов морфологических исследований тканей мозга.

Следует отметить, что ранее степень патогенности штаммов Коксаки В вирусов только по результатам оценки его нейропатогенных свойств не определялась и это предложено впервые авторами изобретения.

Кроме того, авторами в итоге длительных наблюдений за ходом эпидемического процесса энтеровирусных инфекций, вызванных Коксаки В вирусом, было выявлено и доказано, что штаммы группы Коксаки В вирусов способны сохранять свою нейропатогенность во времени (см. там же). Это позволило для оценки степени патогенности исследуемого полевого штамма использовать метод сравнения с известными штаммами Коксаки В вирусов, нейропатогенность которых уже описана, а именно прототипного и контрольного. Прототипный штамм вируса - известный в мире штамм данного вируса, принятый за эталон.

Выбор в качестве контрольных известных штаммов прототипного и эпидемического Коксаки В вирусов позволяет определить степень патогенности исследуемого полевого штамма путем сравнения характера выраженных признаков поражений центральной нервной системы, вызванных исследуемым полевым штаммом, с характером выраженных признаков поражений центральной нервной системы, вызванных в свое время выбранными в качестве контрольных штаммов Коксаки В вирусов. При совпадении характера выраженных признаков поражений центральной нервной системы с признаками, характерными для прототипного и эпидемического штаммов Коксаки В, констатируют, что степень патогенности полевого штамма Коксаки В соответствует эпидемической, в противном случае констатируют, что степень патогенности полевого штамма Коксаки В соответствует межэпидемической.

При этом, поскольку штаммы и прототипный, и эпидемический по степени нейропатогенности соответствуют эпидемическим, это повышает степень достоверности полученных результатов, а следовательно, обеспечивает возможность выполнения предложенного способа с осуществлением заявленного технического результата.

Таким образом, способность штаммов группы Коксаки В вирусов сохранять свою нейропатогенность во времени была обнаружена и доказана авторами изобретения. Ранее это свойство штаммов группы Коксаки В вирусов для определения степени патогенности полевых штаммов Коксаки В вирусов не использовалось и использовано впервые для решения этой задачи авторами изобретения. Причем в заявленном способе свойство штаммов Коксаки В вирусов сохранять свою нейропатогенность во времени использовано как у полевого штамма, так и у контрольных штаммов, что и позволяет его осуществить с заявленным техническим результатом.

Из вышеизложенного следует, что возможность использования для определения степени патогенности полевого штамма Коксаки В вируса результатов исследования нейропатогенных свойств полевого штамма Коксаки В вируса, а также способность группы Коксаки В вирусов сохранять нейропатогенность во времени позволяют определить степень патогенности полевого штамма путем простого сравнения характера выраженных признаков поражений центральной нервной системы, вызванных исследуемым полевым штаммом, с характером выраженных признаков поражений центральной нервной системы, вызванных выбранными в качестве контрольных штаммов Коксаки В вирусов. Это упрощает заявленный способ определения степени патогенности полевого штамма Коксаки В вируса по сравнению с прототипом.

Поскольку заявленный способ определяет степень патогенности штамма Коксаки В вируса, т.е. критерием оценки является степень патогенности, то сравнение, проводимое на уровне биологической модели, правомерно для любого серотипа Коксаки В, что обеспечивает осуществимость заявленного способа, а следовательно, достижение технического результата.

Использование для определения степени патогенности исследуемого полевого штамма линейных мышей объясняется сходством течения заболевания и патологической картины, вызываемой Коксаки В вирусами, у человека и лабораторных мышей. Использование именно линейных мышей объяснятся тем, что они имеют гинетический маркер, который отсутствует у беспородных мышей. Поэтому модель на линейных мышах является оптимальной для осуществления способа, а следовательно, и для достижения технического результата.

Благодаря тому, что исследования проводят в условиях одного гнезда линейных мышей одного помета в возрасте от 2 до 4 дней с маткой, которая обеспечивает кормление мышей, обеспечиваются равные условия для естественного заражения мышей - как внешние, так и на генетическом уровне, что обеспечивает достоверность получаемой информации, а следовательно, и достижение заявленного технического результата. Использование мышей в возрасте от 2 до 4 дней позволяет сократить время инкубационного периода и ускорить получение результатов исследования. Разделение мышей в гнезде на группы, одну из которых подвергают искусственному инфицированию полевым штаммом Коксаки В вируса, создает условия для естественного заражения второй группы мышей и матки, что обеспечивает достоверность полученных результатов, а следовательно, и возможность достижения заявленного технического результата.

Таким образом, из вышеизложенного следует, что заявленный способ определения степени патогенности штамма Коксаки В вируса при осуществлении обеспечивает достижение технического результата, заключающегося в упрощении способа.

Заявленный способ определения степени патогенности штамма Коксаки В вируса выполняют следующим образом. Исследуют нейропатогенность полевого штамма Коксаки В вируса, полученного непосредственно от больного. Исследования проводят в условиях одного гнезда линейных мышей одного помета в возрасте от 2 до 4 дней с маткой. Для этого мышей делят на две группы, одну из которых подвергают искусственному инфицированию полевым штаммом Коксаки В. После чего выполняют исследования нейропатогенности полевого штамма у мышей, зараженных естественным путем. Для чего фиксируют выраженные признаки поражений центральной нервной системы и сравнивают их характер с выраженными признаками поражений центральной нервной системы, характерными для выбранных в качестве контрольных штаммов Коксаки В вирусов. В качестве контрольных берут известные штаммы, прототипный и эпидемический Коксаки В вирусов. После чего по результатам сравнения делают вывод о степени патогенности полевого штамма Коксаки В вируса. При совпадении характера выраженных признаков поражений центральной нервной системы с признаками, характерными для прототипного и эпидемического штамма Коксаки В, констатируют, что степень патогенности полевого штамма Коксаки В соответствует эпидемической. В противном случае констатируют, что степень патогенности полевого штамма Коксаки В соответствует межэпидемической.

Сравнение, проводимое на уровне биологической модели, правомерно для любого серотипа Коксаки В, т.к. критерием оценки является степень патогенности.

Прототипным штаммом для вирусов Коксаки В является штамм Коксаки В3 Nancy, выделенный в США в 1949 году. Хранение штамма - в Госколлекции вирусов Института им. Д.И.Ивановского.

Эпидемический штамм Коксаки В3 1270/585 выделен от больного с поражением центральной нервной системы во время эпидемии энтеровирусной инфекции (ЭВИ), связанной с Коксаки В3 вирусом в г.Екатеринбурге в 1984 году. Хранение штамма - в Госколлекции вирусов Института им. Д.И.Ивановского. Уровень заболеваемости ЭВИ в г.Екатеринбурге в 1984 году - 83,5 на 100 тыс. населения.

В примерах выполнения способа исследования проводили на мышах линии BALB/c в условиях искусственного инфицирования и естественного распространения вируса в гнезде среди животных одного помета. Для исследования брали гнездо с мышью-маткой и с 7 или 8 мышатами-сосунками в возрасте от 2 до 4 дней. В примере 1 и 3 брали гнездо с 8-ю мышатами. Мышат разделяли на равные группы: по 4 мышонка. В примере 2 с 7-ю мышатами разделение проводили на группу искусственного инфицирования - 4 мышонка и естественного заражения - 3 мышонка. Вируссодержащую суспензию испытуемого штамма Коксаки В вводили в дозе 10⁴ ТЦД_50/мл в объеме 0, 025 мл подкожно в область бурого жира. Вторая группа мышат и мышь-матка искусственному инфицированию не подвергались. Выраженность инфекционного процесса у животных оценивали ежедневно в течение 10 суток. Уровень нейропатогенности оценивали путем сравнения фиксируемых признаков поражения центральной нервной системы с выраженными признаками поражений центральной нервной системы, характерными для взятых в качестве контрольных штаммов вирусов Коксаки В - прототипным и эпидемическим. Помимо визуальных наблюдений, которые получали при ежедневном наблюдении за животными с признаками поражения центральной нервной системы: парезы, тремор, расстройство координации движений, выделяли вирус из тканей мозга и выполняли морфологические исследования тканей мозга (степень патогенности определяли при морфологических и/или электронно-микроскопических исследованиях тканей центральной нервной системы инфицированных животных).

Пример 1. Исследовали полевой штамм Коксаки В3 286, выделенный от больного ребенка З.П., 5 лет, госпитализированного в августе 1995 года с поражением центральной нервной системы и диагнозом энтеровирусная инфекция (синдром серозного менингита). Уровень заболеваемости энтеровирусными инфекциями в предыдущем 1994 году в г.Екатеринбурге составлял 16,0 на 100 тыс. населения.

Результаты исследования

В группе естественно инфицированных мышат гибели их не наблюдали. Параличи конечностей и межреберных мышц имели место у одного мышонка. У 3-х других мышат поражения центральной нервной системы ограничивались тремором и расстройством координации движений. Определяемые поражения при патоморфологических исследованиях мозга носили очаговый характер. Специфичность изменений подтверждалась выделением вируса Коксаки В3 из тканей мозга.

Выраженные признаки поражений центральной нервной системы, вызванные исследуемым полевым штаммом Коксаки В3 286 вируса, не совпадали с выраженными признаками поражений центральной нервной системы, характерными для прототипного и эпидемического штаммов Коксаки В. Характерными для прототипного и эпидемического штаммов Коксаки В были признаки: у контактных животных имели место параличи, гибель мышат наступала через 3 дня после контакта с искусственно зараженными мышатами; при патоморфологических исследованиях обнаруживали очаги дистрофических изменений в нервной ткани; при электронно-микроскопических исследованиях в нейронах находили структуры, характерные для вирусного матрикса.

Пример 2

Исследовали полевой штамм В3 143, выделенный от больного ребенка З.К., 3 года, госпитализированного в августе 1995 года с поражением центральной нервной системы и диагнозом энтеровирусная инфекция (синдром серозного менингита).

Штаммы сравнения соответствовали Примеру 1.

Результаты исследования: у 4-х естественно инфицированных мышат наблюдали парезы одной из конечностей, которые проходили к четвертому дню наблюдения. У двух из них были выраженные расстройства координации движения. При патоморфологических исследованиях обнаруживали единичные очаги дистрофических изменений в нервных тканях мозга. Специфическую связь с Коксаки В инфекцией подтверждали выделение вируса из мозга контактных мышат.

Так же, как и в Примере 1, в Примере 2 выраженные признаки поражений центральной нервной системы, вызванные исследуемым полевым штаммом Коксаки В3 286 вируса, не совпадали с выраженными признаками поражений центральной нервной системы, характерными для прототипного и эпидемического штаммов Коксаки В вируса.

Результаты исследования в примерах 1 (полевой штамм Коксаки В3 286 вируса) и 2 (полевой штамм Коксаки В3 143 вируса) позволяют считать данные варианты полевых вирусов типичными межэпидемическими.

Это подтвердил и уровень заболеваемости ЭВИ в г.Екатеринбурге в 1995 году, который составил 7,1 на 100 тыс.населения.

Пример 3

Исследовали полевой штамм Коксаки В5 312, изолированный из носоглоточного смыва ребенка С.Н., 3 года 10 месяцев, госпитализированного в сентябре 2000 года с поражением центральной нервной системы и диагнозом энтеровирусная инфекция (синдром серозного менингита).

Уровень заболеваемости ЭВИ в г.Екатеринбурге в 2000 году составил 16,0 на 100 тыс. населения.

Штаммы сравнения соответствовали Примеру 1.

Результаты исследования

Поражение центральной нервной системы у контактных мышат с инфицированными проявлялось в течение первых суток, параличи - на 3-4 сутки. Из 4-х заразившихся мышат один мышонок погиб на третьи сутки после заражения. В данном случае наблюдали совпадение характера выраженных признаков поражений центральной нервной системы с признаками, характерными для прототипного и эпидемического штаммов Коксаки В, на основании чего был сделан вывод о соответствии степени патогенности исследуемого полевого штамма Коксаки В эпидемическому уровню количества заболеваний. Морфологические исследования подтвердили, что тяжесть поражения нейронов соответствовала эпидемическому и прототипному штаммам.

Полученные результаты Примера 3 свидетельствуют о формировании в циркулирующей популяции вирусов Коксаки В5 вариантов с высокой степенью патогенности, что говорит о возможности эпидемического подъема.

Действительно, в последующие годы: 2003 и 2004 годы эпидемические подъемы сопровождались более частым выделением от заболевших штаммов вирусов Коксаки В5 по сравнению с Коксаки В3. В 2003 и в 2004 годах произошли новые эпидемические подъемы, ассоциированные преимущественно с Коксаки В5 вирусом [Л.Г.Беседина, Н.С.Субботина, Н.Н.Сбитнева, Я.Б.Бейкин / Особенности циркуляции энтеровирусов в г.Екатеринбурге (1992-2005 гг.) // Уральский медицинский журнал, спецвыпуск «Микробиология». Ноябрь, 2006 г.].

Уровень заболеваемости ЭВИ в г.Екатеринбурге в 2003 году составил 30,1 на 100 тыс. населения, а в 2004 году - 40,5 на 100 тыс.населения.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для прогнозирования возможности эпидемий. Определяют степень патогенности энтеровирусных штаммов Коксаки В вируса на основе исследования нейропатогенности полевого штамма Коксаки В вируса в условиях одного гнезда линейных мышей. Мышей делят на две группы. Одну подвергают искусственному инфицированию полевым штаммом. Фиксируют выраженные признаки поражений центральной нервной системы у мышей, зараженных естественным путем. Сравнивают их с характерными для контрольных штаммов Коксаки В вирусов прототипным и эпидемическим. При совпадении характера выраженных признаков поражений центральной нервной системы констатируют соответствие степени патогенности полевого штамма межэпидемической. Изобретение позволяет упростить определение степени патогенности штамма Коксаки В вируса.

Способ определения степени патогенности штамма Коксаки В вируса, включающий исследование штамма Коксаки В вируса, полученного непосредственно от больного - полевой штамм, и определение степени патогенности полевого штамма по результатам исследования, отличающийся тем, что исследуют нейропатогенность полевого штамма Коксаки В вируса, при этом исследования проводят в условиях одного гнезда линейных мышей одного помета в возрасте от 2 до 4 дней с маткой, для чего мышей делят на две группы, одну из которых подвергают искусственному инфицированию полевым штаммом Коксаки В вируса, после чего выполняют исследования нейропатогенности полевого штамма у мышей, зараженных естественным путем, для чего фиксируют выраженные признаки поражений центральной нервной системы и сравнивают их характер с выраженными признаками поражений центральной нервной системы, характерными для взятых в качестве контрольных штаммов вируса Коксаки В, при этом в качестве контрольных берут известные штаммы прототипный и эпидемический Коксаки В вирусов, после чего по результатам сравнения делают вывод о степени патогенности полевого штамма Коксаки В вируса, а именно: при совпадении характера выраженных признаков поражений центральной нервной системы с признаками, характерными для прототипного и эпидемического штаммов Коксаки В, констатируют, что степень патогенности полевого штамма Коксаки В соответствует эпидемической, в противном случае констатируют, что степень патогенности полевого штамма Коксаки В соответствует межэпидемической.