ШТАММ ВИРУСА ЕСНО ТИПА 11 ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ЭНТЕРОВИРУСНОГО УВЕИТА У ДЕТЕЙ Российский патент 1995 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к вирусологии.

Вирусы ЕСНО по международной номенклатуре относятся к семейству Picornaviridae, роду Enteroviruses. Группа вирусов ЕСНО включает более тридцати серологических типов (ЕСНО 1 - ЕСНО 34).

Изучение вирусов ЕСНО стало возможным, начиная с 50-х годов, благодаря усовершенствованию и широкому внедрению метода культур тканей. Первые серологические типы вирусов ЕСНО были выделены в культуре ткани из фекалий здоровых детей с бессимптомной энтеровирусной инфекцией. Вначале из-за отсутствия сведений о связи новоизолированных вирусов с заболеваниями человека они получили название "вирусы-сироты", которое затем было преобразовано в название "вирусы-ЕСНО" (enteric cytopathogenic human orphan - кишечные цитопатогенные человеческие вирусы-сироты).

Вирус ЕСНО 11, эталонный штамм Gregory, был выделен в 1953 г. в штате Огайо (США) из фекалий ребенка с бессимптомной инфекцией.

Последующие наблюдения показали, что инфекция вирусами ЕСНО может иметь следствием не только бессимптомное вирусоносительство, но может сопровождаться развитием таких заболеваний, как менингит, полиомиелит, бронхит, диарея и др. Известно, что варианты вируса ЕСНО 11 могут вызывать у новорожденных детей вспышки смертельного заболевания, протекающего с симптомами менингоэнцефалита, миокардита, гепатита и пневмонии.

До последнего времени в литературе отсутствовала информация о том, что вирусы ЕСНО обладают офтальмотропными свойствами и могут быть этиологической причиной увеита у человека. Увеит - воспаление внутренних структур глазного яблока с преимущественным поражением увеальной (сосудистой) оболочки, относится к числу тяжелых заболеваний глаза, ведущих к снижению или утрате зрительных функций. В 1980-1989 гг. впервые в мировой практике в городах Сибири были зарегистрированы вспышки энтеровирусной инфекции, сопровождавшейся развитием увеита у детей в возрасте преимущественно до 1 г. На основе выделения вирусов от детей, больных увеитом, и выявления сероконверсии возбудителями увеита впервые были признаны энтеровирусы из группы ЕСНО, а именно:
вирус ЕСНО 19, представительный штамм К/452 - Красноярск,1981
вирус ЕСНО 11, представительный штамм Мор/M - Красноярск,1982
вирус ЕСНО 11, представительный штамм Карим/A - Омск,1988.

Установлено, что комплекс клинических симптомов поражения глаз при энтеровирусном увеите не является синдромом, характерным только для этой формы увеита у людей, и сам по себе недостаточен для суждения об этиологии заболевания. Этиологический диагноз заболевания (увеит энтеровирусной этиологии, энтеровирусный увеит) может быть поставлен только на основе лабораторного вирусологического и/или серологического обследования пациентов с увеитом при наличии необходимого спектра специфических диагностических штаммов вирусов.

Целью изобретения является расширение спектра антигенно-различных штаммов вируса ЕСНО 11 для серологической диагностики энтеровирусного увеита у детей.

Вирус ЕСНО 11, штамм Карим/A, изолирован в 1988 г. из фекалий мальчика Каримова А. в возрасте 11 мес. с диагнозом: острый инфекционный увеит правого глаза. Увеит выявлен у ребенка Каримова А. во время внутрибольничных вспышек этого заболевания в Омске в 1987-1988 гг. Всего в тот период в Омске было зарегистрировано 56 случаев увеита у детей в возрасте до 1 г. Изоляция штамма Карим/A вируса ЕСНО 11 произведена в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР, Москва. Штамм Карим/A вируса ЕСНО 11 депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского под номером 2269.

Выделение штамма Карим/A вируса ЕСНО 11 произведено при заражении клеток RD (рабдомиосаркома человека). В пробирки с клетками RD вносили по 0,1 мл 10% -ной суспензии фекалий. Зараженные клетки в пробирках инкубировали при 37оС во вращающемся барабане. При первом пассаже цитопатогенный эффект вируса на клетки RD был определен через 2 д. после заражения культуры. При последующих пассажах цитопатогенное действие вируса проявлялось уже через 1 д после инфицирования. Штамм Карим/A вируса ЕСНО 11 прошел шесть пассажей в клетках RD. Вирус хранится при -20^оС в течение более 3х лет (срок наблюдения) без существенного снижения инфекционности.

Штамм Карим/A вируса ЕСНО 11, разделяет следующие общие свойства, присущие вирусам группы ЕСНО рода Enteroviruses:
устойчив к эфиру, что обусловлено отсутствием у вируса структурных липоидов; полностью сохраняет инфекционность после обработки вирусных препаратов 20%-ным этиловым эфиром в течение 18 ч при 4^оС;
устойчив к тепловой инактивации в присутствии катионов; сохраняет жизнеспособность при прогревании в течение 1 ч при 50^оС в присутствии MgCl₂;
нечувствителен к антибиотикам;
хорошо размножается в культурах клеток человеческого и обезьяньего происхождения; титр вируса составляет: в клетках перевиваемой линии рабдомиосаркомы человека (RD) - 10^8,0 - 10^9,0 ТЦД₅₀/мл; в диплоидных клетках легких эмбриона человека (КЭЧ) и в клетках первичной культуры почки обезьян (КТП) - 10^6,5 - 10^7,5 ТЦД₅₀/мл;
не патогенен для новорожденных белых мышей и новорожденных хлопковых крыс.

Антигенные свойства. Штамм Карим/A представляет собой специфическую антигенную разновидность вируса ЕСНО 11. Штамм Карим/A вируса ЕСНО 11 отличается по антигенности от эталонного штамма Gregory вируса ЕСНО 11 и от штамма Мор/M вируса ЕСНО 11, выделенного при вспышке увеита в Красноярске в 1982 г. Различия между штаммами выявлены в реакции нейтрализации, которая учитывалась в культуре клеток КЭЧ (табл. 1).

Коммерческие антисыворотки к вирусу ЕСНО 11, штамм Gregory, приготовленные как в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов (ИПВЭ) АМН СССР, Москва, так и в Национальном институте аллергии и инфекционных болезней (НИАИБ), Бетезда, США, нейтрализуют гомологичный штамм Gregory в разведении (1: 1024)-(1:2048) и гетерологичные штаммы Карим/A и Мор/M в разведении (1: 16)-(1: 64). Кроличья антисыворотка к вирусу ЕСНО 11, штамм Карим/A имеет высокую нейтрализующую активность по отношению к гомологичному штамму Карим/A ((1:4096)-(1:8192)) и меньшую нейтрализующую активность по отношению к штамму Gregory и Мор/M ((1:256)-(1:512)). Кроличья антисыворотка к вирусу ЕСНО 11, штамм Мор/M нейтрализует штамм Мор/M в разведении 1:2048 и штамм Gregory и Карим/A в разведении (1:16)-(1:128).

Увеатропные свойства. Штамм Карим/A вируса ЕСНО 11 обладает ярко выраженным увеатропизмом в экспериментах на обезьянах (яванские макаки, макаки резус, зеленые мартышки). Этот вирус при введении в переднюю камеру глаза обезьян в дозе 10^7,0-10^8,0 ТЦД₅₀/мл регулярно вызывает тяжелое поражение внутренних структур глазного яблока, протекающее по типу переднего увеита. Увеит, развивающийся у обезьян при заражении вирусом ЕСНО 11, штамм Карим/A, по клинической картине и патоморфологическим проявлениям очень сходен с ЕСНО-вирусным увеитом, наблюдаемым у детей раннего возраста.

Эталонный штамм Gregory вируса ЕСНО 11 не обладает или обладает очень слабо выраженными увеатропными свойствами. При введении вируса в переднюю камеру глаза обезьян увеит удается воспроизвести нерегулярно у единичных животных; клиника увеита при этом едва заметна и выражается в легком изменении цвета радужки.

П р и м е р. Применение штамма Карим/A вируса ЕСНО 11, для лабораторной серодиагностики энтеровирусного увеита у детей.

Установлено, что причиной вспышек увеита в Сибири в 1980-1989 гг. последовательно послужили вирусы ЕСНО, относящиеся к трем антигенным разновидностям, а именно к одной антигенной разновидности вируса ЕСНО 19 и к двум антигенным разновидностям вируса ЕСНО 11. В качестве представительных штаммов трех указанных групп вирусов взяты: вирус ЕСНО 19, штамм К/452 (Красноярск, 1981), вирус ЕСНО 11, штамм Мор/M (Красноярск, 1982) и вирус ЕСНО 11, штамм Карим/A (Омск, 1988). Прослежено, что дети, перенесшие увеит во время сибирских вспышек, длительно (в течение 5-10 лет) сохраняют высокой уровень специфических нейтрализующих антител к вирусу - возбудителю. На этой основе три сибирских антигенных варианта вирусов ЕСНО 19 и ЕСНО 11 стали использоваться как диагностические препараты в лабораторной практике для своевременной или ретроспективной серодиагностики увеита у детей, проживающих в разных регионах страны. Для этого сыворотки крови детей с подозрением на энтеровирусный увеит или с увеитом неясной, неустановленной этиологии испытывали в реакции нейтрализации параллельно с набором, включающим три представительных сибирских штамма вирусов: вирус ЕСНО 19, штамм К/452, вирус ЕСНО 11, штамм Мор/M и вирус ЕСНО 11, штамм Карим/A. Наличие у ребенка с увеитом антител к одному из указанных вирусов ЕСНО 19 или ЕСНО 11 в титре (1: 512)-(1:2048) служит неоспоримым доказательством причастности этого вируса ЕСНО к возникновению заболевания и дает полное основание ставить лабораторный диагноз: увеит энтеровирусной этиологии (энтеровирусный увеит). Менее высокий титр антител ((1:64)-(1:128)) в сочетании с комплексом клинических энтеровирусных симптомов увеита и характерного эпиданамнеза также может рассматриваться как основание для диагноза: энтеровирусный увеит.

Эталонные штаммы вирусов ЕСНО 11 (Gregory) и ЕСНО 19 (Burke) ввиду своего антигенного отличия от возбудителей увеита - сибирских офтальмотропных штаммов вирусов ЕСНО 11 и ЕСНО 19 непригодны для серологической диагностики энтеровирусных увеитов у детей.

В табл. 2 представлен пример серологического определения этиологии увеита у детей с помощью использования в качестве антигенов сибирских офтальмотропных вариантов вирусов ЕСНО 19 и ЕСНО 11. В 1-4 случаях с увеитом неясной этиологии или с увеитом предположительно (по клинике) энтеровирусной этиологии, исходя из результатов реакции нейтрализации (титр антител (1: 128)-(1: 8192)), поставлен лабораторный диагноз: энтеровирусный увеит, выявлено, что увеит вызван одним из трех вариантов вирусов ЕСНО 19 или ЕСНО 11. В 5 и 6 случаях связь заболевания глаз с офтальмотропными сибирскими вариантами вирусов ЕСНО 19 и ЕСНО 11 не установлена.

В целом применение в лабораторной офтальмологической практике метода серодиагностики с использованием набора сибирских вариантов вирусов ЕСНО 19 и ЕСНО 11 впервые позволило поставить диагноз: энтеровирусный увеит, у 129 из 165 обследованных детей с предварительным клиническим диагнозом: подозрение на энтеровирусный увеит или увеит неясной этиологии. Из числа указанных 129 детей с серологически установленным диагнозом: энтеровирусный увеит, заболевание глаз было связано: у 6 человек - с вирусом ЕСНО 19, штамм К/452, у 68 человек - с вирусом ЕСНО 11, штамм Мор/M и у 55 человек - с вирусом ЕСНО 11, штамм Карим/A. Серологические исследования показали, что заболеваемость энтеровирусным увеитом имеет место не только в Сибири, но распространена во многих других районах страны.

Полученные результаты важны для практической медицины, так как правильно и своевременно поставленный этиологический диагноз увеита, в том числе энтеровирусного увеита, необходим клиницистам-офтальмологам для выбора оптимального, патогенетически ориентированного способа лечения этого заболевания у детей.

Кроме того, сведения о широком географическом распространении энтеровирусного увеита и о продолжающемся развитии эпидемического процесса, связанного с этой инфекцией, ориентируют практическое здравоохранение на необходимость организации соответствующих профилактических и лечебных мероприятий при появлении новых единичных случаев и вспышек энтеровирусного увеита на разных территориях страны.

Область применения: вирусология. Сущность изобретения: штамм Карим/А вируса ЕСНО 11 изолирован в 1988 г. из фекалий 11-месячного мальчика с острым увеитом правого глаза. Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д. И.Ивановского, N 2269. Штамм Карим/А вируса ЕСНО 11 обладает ярко выраженным офтальмотропизмом в экспериментах на обезьянах. Штамм вызывает у обезьян тяжелый увеит, очень сходный по клинике с энтеровирусным увеитом у детей. Офтальмотропный штамм Карим/А представляет собой антигенную разновидность вируса ЕСНО 11. В реакции нейтрализации штамм Карим/А отличается по антигенности от эталонного штамма Gregory вируса ЕСНО 11 и от офтальмотропного штамма Мор/М вируса ЕСНО 11 - возбудителя вспышки увеита в Красноярске в 1982 г. Штамм Карим/А вируса ЕСНО 11 используется как диагностический антигенный препарат в реакции нейтрализации для осуществления специфической серологической диагностики энтеровирусного увеита у детей. Выявление у детей с увеитом неясной этиологии антител к штамму Карим/А в титре 1 : 64 и выше [обычно (1 : 512) - (1 : 2048)] является убедительным лабораторным доказательством этиологической причастности к заболеванию глаз вируса ЕСНО 11, антигенно близкого штамм Карим/А. 2 табл.

ШТАММ ВИРУСА ЕСНО ТИПА 11 ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ЭНТЕРОВИРУСНОГО УВЕИТА У ДЕТЕЙ.

Штамм вируса ЕСНО типа 11 ГКВ N 2269 для серологической диагностики энтеровирусного увеита у детей.