АМИД НОНАПЕПТИДА, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ ПРЕДОТВРАЩАТЬ ПОВЫШЕНИЕ ПРОНИЦАЕМОСТИ ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ Российский патент 2010 года по МПК C07K7/00 A61K38/08 A61P7/10 

Изобретение относится к биологически активным пептидам, способным предотвращать острое повышение проницаемости сосудистого эндотелия и может найти применение в медицине в качестве противоотечного средства.

Отек жизненно важных органов (легких, мозга и др.) является грозным осложнением различных патологических состояний, с которым нередко сталкиваются врачи-кардиологи, инфекционисты, токсикологи, нейрохирурги, специалисты в области военно-полевой медицины и медицины катастроф. Развитие отека легких является показанием к преждевременной отмене агрессивной терапии у некоторых групп онкологических больных. Отек тканей является отрицательным побочным действием терапевтического ангиогенеза с помощью фактора роста сосудистого эндотелия, приводящего к образованию т.н. «текущих» капилляров.

Несмотря на достижения в медицинских технологиях, смертность от острого отека легких в России и развитых странах мира остается высокой, что связано, в частности, с отсутствием эффективных противоотечных препаратов. Сегодня арсенал врача ограничен диуретиками - веществами, улучшающими выведение жидкости из организма через почки, кристаллоидами, повышающими внутрисосудистое осмотическое давление, и стероидными гормонами. Эти соединения не воздействуют на основное патогенетическое звено в развитии отека - на эндотелиальную выстилку микрососудов.

По современным представлениям для эффективной борьбы с развитием острого отека и постишемическим повреждением ткани необходимо ослабить сократительную реакцию микрососудистого эндотелия, воздействуя на критические звенья этого процесса, а именно на основной моторный белок эндотелия - немышечный миозин II типа и/или на его активаторы. Ключевым активатором миозина в эндотелиальных и других клетках является киназа легких цепей миозина (КЛЦМ), ингибиторы которой могли бы претендовать на роль средств, предотвращающих отек.

Однако большинство из синтезированных ранее ингибиторов КЛЦМ не подходит для применения у человека по причине низкой специфичности, следствием чего может быть возникновение серьезных побочных эффектов [1]. В связи с этим поиск ингибиторов КЛЦМ весьма актуален.

Одним из таких соединений является низкомолекулярный ингибитор на основе аминопирадазина [2-4]. В последние годы в мире разрабатываются пептидные ингибиторы КЛЦМ, влияющие на проницаемость кишечного эпителия, в эксперименте и не обладающие выраженной токсичностью [5]. Известен нонапептид на основе аминокислотной последовательности автоингибиторного участка КЛЦМ H-Arg-Lys-Lys-Tyr-Lys-Tyr-Arg-Arg-Lys-NH₂ (L-ПИК) [6]. Этот пептид in vitro способен оказывать влияние только на проницаемость эпителия, но не эндотелия сосудов [5]. Кроме того, в силу особенностей его химической структуры L-ПИК чрезвычайно подвержен действию протеолитических ферментов и не может претендовать на использование в практической медицине.

Задачей изобретения является создание препарата, который бы обладал выраженной способностью подавлять острое повышение проницаемости сосудистого эндотелия. Актуальность этой задачи обусловлена необходимостью обеспечения практической медицины эффективными препаратами противоотечного действия.

Поставленная задача решается созданием ранее неизвестного амида нонапептида формулы H-(N-Me)-Arg-Lys-Lys-Tyr-Lys-Tyr-Arg-Arg-Lys-NH₂ (I) и его фармацевтически приемлемых солей. Поскольку в ряду пептидных аналогов не существует четкой взаимосвязи структура-активность, способность данного соединения воздействовать на изменение проницаемости сосудистого эндотелия не является очевидной.

Заявляемый пептид получали твердофазным методом пептидного синтеза с использованием Fmoc-технологии, описанным ниже в примере 1.

Пример 1. Синтез заявляемого пептида (I)

Список сокращений:

АА - аминокислота;

Boc - трет-бутилоксикарбонил;

ВОР - гексафторфосфат (бензотриазол-1-ил)окси-

трис(диметиламино)фосфония;

Bu^t - трет-бутил;

DIC -N,N'-диизопропилкарбодиимид;

DIPEA-N,N'-диизопропилэтиламин;

DCM - дихлорметан;

DMSO-d₆ - дейтерированный диметилсульфоксид;

Fmoc - 9-флуоренилметоксикарбонил;

НОВТ - 1-гидроксибензотриазол;

Mtr - 4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонил;

Me - метил;

NMP - N-метилпирролидон;

Pip - пиперидин;

Pmc - 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил;

TIBS - триизобутилсилан;

TFA - трифторуксусная кислота;

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография.

В работе использованы производные L-аминокислот (Bachem, Швейцария), DIC, DIPEA, HOBt, TIBS (Fluka, Швейцария). Для синтеза применяли N-метилпирролидон, дихлорметан, пиперидин, метанол и TFA (Applied Biosystems GmbH, Германия). Аналитическую ВЭЖХ проводили на хроматографе (Gilson, Франция), использовали колонку Nucleosil 100 С18, 5 мкм (4.6×250 мм) (Sigma, США), в качестве элюентов использовали буфер А - 0.1% TFA, буфер Б - 80% ацетонитрила в буфере А, элюция градиентом концентрации буфера Б в буфере А от 0% до 60% за 30 мин. Скорость потока 1 мл/мин, детекция при 220 нм. Структура полученных пептидов доказана спектрами ¹Н-ЯМР и данными масс-спектрометрии. ¹Н-ЯМР-спектры снимали на спектрометре WM-500 (Bruker) 500 МГц (ФРГ) в DMSO-d₆ при 300 К, концентрация пептидов составляла 2-3 мг/мл. Химические сдвиги измерялись относительно тетраметилсилана. Масс-спектры регистрировали на приборе PC-Kompact MALDI (Kratos, Англия).

Для твердофазного синтеза использовали сополимер стирола с 1% дивинилбензола с 4-(2,4-диметоксифенил)-Fmoc-аминометилфенокси - якорной группой (Rink-amide-полимер) фирмы Nova BoiChem, Швейцария, предназначенный для получения амидов пептидов, содержащий 0.56 ммоль/г аминогрупп. Синтез амида нонапептида проводили с С-конца, ступенчато (присоединяя по одной аминокислоте), исходя из 0.45 г (0.25 ммоль) Rink-amide-полимера. Первые 8 циклов синтеза проводили в автоматическом режиме на пептидном синтезаторе Applied Biosystems 431А по стандартной программе для однократной конденсации Fmoc-аминокислот. Для блокирования гуанидиновых групп остатков Arg⁷ и Arg⁸ использовали Pmc-защиту (см. ниже протокол твердофазного синтеза). Для присоединения N-концевого, N-метилзамещенного остатка Arg¹ использовали Mtr-защиту гуанидиновой функции, а для создания амидной связи применяли высокоэффективный реагент Кастро - ВОР [7].

Протокол твердофазного синтеза № Операция Реагент Время обработки Циклы 1-8 1 Промывка 5×NMP 3 мин 2 Деблокирование α-аминогрупп 20% Pip/NMP 10 мин 3 Промывка 5×NMP 3 мин 4 Активация 1 ммоль Fmoc-AA+1 ммоль НОВТ+1 ммоль DIC в NMP 20 мин 5 Конденсация 1 ммоль активированного производного Fmoc-AA в NMP 90 мин 6 Промывка 5×NMP 3 мин Цикл 9 1 Промывка 5×NMP 3 мин 2 Деблокирование α-аминогрупп 20% Pip/NMP 10 мин 3 Промывка 5×NMP 3 мин 4 Активация 1 ммоль Fmoc-(N-Me)Arg(Mtr)-OH+1 ммоль ВОР+1 ммоль НОВТ+2 ммоль DIPEA в NMP 5 мин 5 Конденсация 1 ммоль активированного производного Fmoc-AA в NMP 90 мин 6 Промывка 5×NMP 3 мин

Заключительное деблокирование и отщепление нонапептида от полимера проводили в одну стадию путем обработки соответствующего нонапептидилполимера смесью 10 мл TFA, 0.25 мл деионизованной воды и 0.25 мл TIBS в течение 16 ч. Затем полимер отфильтровывали, промывали 2×2 мл деблокирующей смеси, фильтрат упаривали и к остатку прибавляли сухой эфир. Осадок отфильтровывали, промывали DCM (3×3 мл), эфиром (3×5 мл), сушили в вакуум-эксикаторе. Сырой продукт твердофазного синтеза с содержанием основного вещества 65% очищали с помощью препаративной ВЭЖХ на приборе Beckman (США), используя колонку Диасорб С16 130Т (25×250 мм), размер частиц сорбента 10 мкм. В качестве элюентов использовали буфер А - 0.01 М раствор ацетата аммония и буфер Б - 80% ацетонитрила в воде. Элюцию проводили градиентом 0.5% в минуту буфера Б в буфере А от 100% буфера А со скоростью 10 мл/мин. Пептиды детектировали при длине волны 220 нм. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяли, ацетонитрил упаривали и лиофилизовали. В итоге получили 0.13 г (38.8% в расчете на стартовую аминокислоту, присоединенную к полимеру) амида нонапептида. Гомогенность продукта, определенная с помощью аналитической ВЭЖХ, составляет 96%. Масс-спектр: 1338.6, вычислено 1338.7.

Пример 2. Проницаемость эндотелия in vitro. Влияние пептида (I) на проницаемость эндотелия проверяли, анализируя скорость диффузии ФИТЦ-альбумина через монослой эндотелиальных клеток EA.hy926 (см. чертеж).

Эндотелиальные клетки высаживали на пористые мембраны вкладышей специальных диффузионных камер в количестве 2×10⁴ клеток на мембрану и культивировали в среде роста ДМЕМ (Dulbecco's modification of Eagle's medium) с высоким содержанием глюкозы в присутствии 10% эмбриональной телячьей сыворотки в течение 4 дней. За это время клетки достигали монослоя. Среду роста меняли на ДМЕМ с 0.1% эмбриональной сыворотки и проводили депривацию клеток в течение 3 часов.

1) В верхнюю камеру добавляли 1 мг/мл флуоресцеинизотиоцианат-(ФИТЦ)-альбумина и каждые 30 мин отбирали пробы из нижней камеры для расчета базальной скорости диффузии ФИТЦ-альбумина через эндотелиальный монослой (относительные единицы интенсивности флуоресценции/час). Содержание ФИТЦ-альбумина в пробах измеряли с помощью спектрофлуориметра. Результаты представляли как среднее±стандартное отклонение (см. чертеж). Достоверность отличий определяли по t-критерию Стьюдента. Полученное значение базальной скорости диффузии ФИТЦ-альбумина использовалось в качестве контроля (белый столбик на чертеже).

2) Изменение (повышение) проницаемости эндотелиальных клеток индуцировали добавлением 100 нМ тромбина в верхнюю камеру, продолжая периодический отбор проб среды из нижней камеры для анализа содержания в ней ФИТЦ-альбумина. При этом через 1.5 часа после добавления тромбина проницаемость клеток возрастала в 2.5 раза (черный столбик на чертеже).

3) Для оценки влияния пептида (I) на проницаемость эндотелиальных клеток, подготовленных, как указано в п.1), в верхнюю и нижнюю камеры добавляли пептид (I) в концентрации 100 µМ, инкубировали 1 час, после чего в верхнюю камеру добавляли 100 нМ тромбина и оценивали содержание ФИТЦ-альбумина, отбирая пробы из нижней камеры, так же, как в п.2). При этом преинкубация эндотелиальных клеток с пептидом снижала реакцию на тромбин в 1.6 раза (серый столбик на чертеже). Из приведенного примера видно, что заявляемый пептид (I) способен влиять на проницаемость монослоя эндотелиальных клеток, индуцированную тромбином. Проницаемость клеток возрастала в 2.5 раза через 1.5 часа после добавления 100 нМ тромбина, в то время как их преинкубация с 100 µМ пептида в течение 1 часа снижала реакцию на тромбин в 1.6 раза. Таким образом, из приведенного примера видно, что заявляемый пептид (I) способен предотвращать острое повышение проницаемости монослоя эндотелиальных клеток, индуцированное тромбином.

Заявляемый пептид (I) более устойчив к действию протеолитических ферментов, чем прототип (L-ПИК), так как С-концевая часть его молекулы защищена от действия карбоксипептидаз амидной функцией, а N-концевая часть содержит остаток N-алкиламинокислоты - N-метиларгинина, что повышает устойчивость к действию аминопептидаз. На примерах синтеза и изучения пептидных ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента (АПФ) [8] и аналогов эндорфинов [9] показано, что введение в пептидную цепь N-метиламинокислот существенно повышает устойчивость этих соединений к ферментативной биодеградации, в том числе к действию амино- и карбоксипептидаз. Благодаря высокой устойчивости к действию ферментов пептид формулы (I) может найти применение в медицине в качестве противоотечного средства.

Заявляемый пептид нетоксичен, поскольку является аналогом части эндогенного белка КЛЦМ, не обладающего токсическими свойствами и состоит из остатков природных аминокислот, которые обычно присутствуют в организме.

Изобретение относится к биологически активным пептидам, способным предотвращать острое повышение проницаемости сосудистого эндотелия. Предложен пептид формулы H-(N-Me)-Arg-Lys-Lys-Tyr-Lys-Tyr-Arg-Arg-Lys-NH₂ и его фармацевтически приемлемые соли. Заявленный пептид может найти применение в качестве противоотечного средства в различных областях медицины (в кардиологии, токсикологии, нейрохирургии и др.). 1 ил., 1 табл.

Пептид H-(N-Me)-Arg-Lys-Lys-Tyr-Lys-Tyr-Arg-Arg-Lys-NH₂ и его фармацевтически приемлемые соли.