ВИРУСНЫЙ ВЕКТОР ДЛЯ ПРОДУКЦИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ В РАСТЕНИЯХ Российский патент 2010 года по МПК C12N15/83 

Область применения

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности к разработке способов продукции в клетках растений рекомбинантных белков для медицины и промышленности.

Актуальность

Успехи в области генетической инженерии растений, исследования фундаментальных механизмов экспрессии растительных генов, открыли новые возможности в использовании растений в качестве биофабрик для получения рекомбинантных белков, в том числе белков медицинского назначения, таких как антитела, вакцины и т.п. Производство целевых белков в растениях имеет существенные преимущества по сравнению с использующимися в настоящее время для этих целей системами экспрессии на основе клеток животных, дрожжей или бактерий. Культивирование растений не требует больших затрат, за счет чего стоимость целевых белков, выделяемых из растений, оказывается существенно ниже стоимости аналогичных продуктов, полученных в других экспрессионных системах. Кроме того, использование растений вместо микроорганизмов или клеток животных исключает риск передачи человеку патогенов или токсинов. Одним из наиболее эффективных методов, позволяющих быстро получать в растениях значительные количества целевого белка, является использование самореплицирующихся рекомбинантных вирусных векторов. Поэтому актуальной задачей является создание высокоэффективных вирусных систем продукции рекомбинантных белков в растениях.

Уровень техники

Принцип работы вирусной системы экспрессии состоит в конструировании рекомбинантного растительного вируса, в геном которого интегрирован ген, кодирующий целевой рекомбинантный белок. При заражении таким модифицированным вирусом растения синтезируют не только собственные белки вируса, но и целевой белок.

Обычно для создания вирусных систем экспрессии используют вирус табачной мозаики или Х-вирус картофеля, геномы которых имеют небольшие размеры и содержат плюс цепь РНК [1, 2, 3]. Например, геном Х-вируса картофеля (ХВК) содержит 5 генов: ген РНК-зависимой РНК-полимеразы, три гена, составляющих так называемый тройной блок генов, функции которых связаны с межклеточным транспортом вируса, а также ген белка оболочки. При попадании вирусной РНК в клетку растения происходит ее трансляция и синтез продукта первого гена - РНК-полимеразы. Остальные гены при этом не экспрессируются, поскольку эукариотические РНК являются функционально моноцистронными, т.е. транслируется только ближайший к 5'-концу РНК ген. Экспрессия остальных генов является результатом синтеза РНК-полимеразой набора более коротких «субгеномных» РНК, соответствующих этим генам. При конструировании вирусного вектора можно заменить один из вирусных генов целевым геном или вставить целевой ген в качестве «дополнительного» гена под контролем дополнительного промотора «субгеномной» РНК.

Использование вирусных векторов позволяет в течение нескольких дней экспрессировать в растениях целевые белки на уровне до 20-30% общего растворимого белка [4], хотя для практически значимых белков эта величина оказывается существенно более низкой (в пределах нескольких процентов общего белка). Векторы на основе геномов фитовирусов успешно применяются для продукции в растениях белков медицинского назначения, в том числе вакцинных белков возбудителей бешенства [5], чумы [6], В-субъединицы термолабильного энтеротоксина [7], антител [8] и многих других [см. обзор 9].

Повышение эффективности вирусных систем экспрессии возможно несколькими способами. Во-первых, в результате подавления антивирусных защитных реакций растения, приводящие к специфической деградации вирусной РНК (посттранскрипционный ген-сайленсинг). Во-вторых, за счет стабилизации рекомбинантной вирусной РНК, достигаемой, например, введением в нее нитронов и удалением потенциальных сайтов сплайсинга. Также оптимизируются методы введения рекомбинантного вирусного генома в растительные клетки.

Наряду с содержанием мРНК в клетке уровень экспрессии генов растений и эукариот вообще может регулироваться на стадии трансляции этой мРНК. Эффективные трансляционные энхансеры могут, во-первых, повысить уровень экспрессии целевого гена, а во-вторых, обеспечить его специфическую трансляцию в определенных тканях или в определенных условиях внешней среды. Примером трансляционного энхансера, повышающего эффективность трансляции мРНК в растениях и бесклеточных системах трансляции, является 5'-нетранслируемая (лидерная) последовательность РНК 4 вируса мозаики люцерны, далее именуемая «AMV» [10]. Однако влияние этой последовательности, равно как и других трансляционных энхансеров, на эффективность вирусных векторов не исследовалось.

Раскрытие изобретения

В настоящем изобретении ставилась задача создания вирусного вектора, обеспечивающего продукцию рекомбинантных белков в растениях с высокой эффективностью, благодаря наличию в геноме вектора последовательности AMV (ТТТТТАТТТТТААТТТТСТТТСАААТАСТТССАТСА) перед целевым геном.

Фактически задача была решена путем:

а) конструирования на основе генома Х-вируса картофеля вирусных векторов, отличающихся наличием или отсутствием AMV перед целевым геном;

б) сравнения уровней продукции целевого белка в растениях с помощью этих векторов.

Первым аспектом изобретения является конструирование предназначенного для продукции рекомбинантных белков в растениях вирусного вектора pA7248AMV-T на основе генома вируса Х картофеля, содержащего последовательность трансляционного энхансера AMV перед целевым геном.

Вторым аспектом изобретения является конструирование пары рекомбинантных вирусных векторов, обеспечивающих продукцию в растениях зеленого флуоресцентного белка и отличающихся наличием или отсутствием AMV.

Третий аспект изобретения связан с определением уровней продукции в растениях белка GFP при использовании этих векторов в результате вестерн-блот-анализа белковых препаратов, выделенных из растений-продуцентов. При этом было показано, что уровень синтеза GFP при использовании вектора, содержащего последовательность AMV, примерно в 4 раза выше, чем для аналогичного вектора без AMV.

Четвертый аспект изобретения подтверждает, что достигнутое улучшение связано именно с функционированием AMV в качестве трансляционного энхансера, а не с повышением содержания мРНК целевого гена gfp в клетке, которое могло бы являться неспецифическим эффектом введения AMV и/или обусловленного им изменения структуры мРНК.

Краткое описание рисунков

На чертеже изображены структуры вирусных векторов.

Показаны структуры Т-ДНК областей вирусных векторов pA7248AMV-T и рА7248-Т, участки за пределами т-ДНК показаны пунктирными линиями. Границы Т-ДНК (бордеры, «В») отмечены жирными вертикальными линиями. 5'-5'-нетранслируемая область генома ХВК; 3'-3'-нетранслируемая область генома ХВК; RDRP - РНК-зависимая РНК полимераза ХВК; Sgp1 - первый субгеномный промотор РНК ХВК. 35S - промотор, 35S-T - терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты. Tet - ген устойчивости к тетрациклину. AMV - ДНК-копия лидерной последовательности РНК вируса мозаики люцерны. Первый кодон целевого гена подчеркнут, нуклеотидная последовательность AMV (ТТТ ТТА ТТТ ТТА АТТ ТТС ТТТ САА АТА СТТ ССА ТСА) выделена серым, последовательности сайтов рестрикции Xbal, AscI выделены курсивом. Векторы pA7248AMV-GFP и pA7248-GFP отличаются от соответственно векторов pA7248AMV-T и рА7248-Т тем, что содержат ген gfp вместо гена Tet.

Осуществление изобретения

Пример 1. Конструирование вирусного вектора pA7248AMV-T, содержащего последовательность трансляционного энхансера AMV перед целевым геном

В качестве основы для создания вектора был использован описанный в работе [11] вирусный вектор PVXdt, основанный на геноме вируса Х картофеля (ХВК). Этот вектор включает 5'-нетранслирумый участок генома ХВК, ген полимеразы, первый промотор субгеномной РНК, целевой ген, последние 60 нуклеотидов гена белка оболочки и 3'-нетранслируемый участок генома ХВК. Вся эта конструкция помещена между 35S промотером и 35S терминатором и клонирована в бинарном векторе pBIN19. При доставке в клетки с помощью агроинфильтрации листьев происходит заражение большей части клеток листа в инфицированной области, репликация вирусного вектора в отдельных клетках, синтез субгеномной РНК и экспрессия продукта на высоком уровне [11].

В качестве основы мы использовали вектор PVXdt. На первом этапе мы клонировали в нем ПЦР-фрагмент, содержащий последовательность XbaI-AMV-AscI-Tet-SmaI-BsrGI, кодирующую ген устойчивости к тетрациклину. Соответствующий фрагмент ДНК был получен в результате проведения ПЦР с использованием праймеров TetXAMVA (ТGТ ТСТ AGA ТТТ ТТА ТТТ ТТА АТТ ТТС ТТТ САА АТА СТТ ССА ТСА GGC GCG CCG ТСА ССТ ААА TAG СТТ GGC G) и TetBS (CAT TGT АСА ССС GGG ТТС CAT ТСА GGT CGA GGT G). В качестве матрицы использовали плазмиду pKRP12 [12], содержащую последовательность гена устойчивости к тетрациклину. ПЦР проводили при следующих условиях: (1) 94°С - 40 сек, (2) 52°С - 40 сек, (3) 72°С - 120 сек, шаги 1-3 повторяли 40 раз.

После электрофоретического разделения продуктов ПЦР выделяли фрагмент размером приблизительно 1,7 т.п.н., которые обрабатывали рестриктазами XbaI и BsrGI и лигировали с ДНК вектора PVXdt, предварительно обработанной рестриктазами XbaI и BsrGI (продукты рестрикции разделяли электрофоретически в агарозном геле и выделяли фрагмент вектора 17 т.п.н.). Таким образом был сконструирован вирусный экспрессионный вектор pA7248AMV-T, содержащий последовательность трансляционного энхансера AMV перед целевым геном (см. чертеж). Данный вектор содержит уникальные рестрикционные сайты AscI, SmaI, позволяющие проводить клонирование целевых генов в один этап.

Аналогичным образом был сконструирован вирусный вектор рА7248-Т, отличающийся от pA7248AMV-T отсутствием последовательности AMV (см. чертеж). Для этого при выполнении описанных выше генно-инженерных операций вместо праймера TetXAMVA был использован праймер TetXA (TGT ТСТ AGA GGC GCG CCG ТСА ССТ ААА TAG СТТ GGC G).

Пример 2. Конструирование пары вирусных векторов, отличающихся наличием или отсутствием AMV перед целевым геном gfp

Используя сайты рестрикции AscI, SmaI, мы удалили из векторов pA7248AMV-T и рА7248-Т ген устойчивости к тетрациклину и клонировали на его месте ген зеленого флуоресцентного белка gfp. В результате были получены рекомбинантные векторы pA7248AMV-GFP и pA7248-GFP. Эти векторы содержат в качестве целевого ген gfp и отличаются только наличием или отсутствием последовательности AMV между промотором субгеномной РНК и gfp.

Пример 3. Определением уровней продукции в растениях белка GFP с помощью вирусных векторов pA7248AMV-GFP и pA7248-GFP

Для сравнения эффективности сконструированных нами векторов проводили эксперимент по транзиентной экспрессии гена gfp. Для этого агробактерии, содержащие экспрессионные векторы, вводили в клетки N. benthamiana с помощью агроинфильтрации. Для этого агробактерии, содержащие рекомбинантные бинарные векторы, выращивали в течение 12 ч на шейкере при 28°С. Клетки (1,5 мл) осаждали центрифугированием (4000g, 5 мин), осадок ресуспендировали в 1,5 мл буфера, содержащего 10 мМ MES (рН 5.5) и 10 мМ MgCl₂, оптическую плотность доводили до OD₆₀₀=0,2. Листья растений N. benthamiana инъецировали суспензией агробактерии при помощи шприца без иглы.

На одном листе одновременно находились зоны агроинфильтрации, соответствующие двум вирусным векторам. Опыт проводили независимо на трех листьях. Через 3 суток из зон агроинфильтрации отбирали пробы растительной ткани. Листовой материал (10 мг) растирали до образования однородной суспензии в экстракционном буфере (0.4М сахароза, 50 мМ Трис рН 8.0, 10 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 10% глицерин, 10 мМ β-меркаптотанол). Полученную смесь центрифугировали при 14000g в течение 15 минут и отбирали супернатант, в котором содержались белки. Концентрации белков определяли по методу Брэдфорд.

Количественное определение белка GFP проводили флуориметрически. Белковые экстракты (25 мкг) растворяли в 3 мл буфера 50 mМ Na-фосфатный буфер рН 7.0, 200 mM NaCl и определяли количество GFP на флуориметре "Флюорат-02" (ЛЮМЭКС) (возбуждение 390 нм, эмиссия 510 нм).

Результаты, представленные в Таблице, показывают, что уровень синтеза GFP при использовании вектора, содержащего последовательность AMV, примерно в 4 раза выше, чем для аналогичного вектора без AMV.

Количество синтезируемого GFP Лист Проба Количество GFP в отн.ед. Лист 1 pA7248AMV-GFP 3,36 pA7248-GFP 1 Лист 2 pA7248AMV-GFP 3,48 pA7248-GFP 1 Лист 3 pA7248AMV-GFP 4,03 pA7248-GFP 1 среднее значение pA7248AMV-GFP 3,6±0,4 pA7248-GFP 1

Для каждого листа уровень продукции GFP для вектора pA7248-GFP принимали за 1.

Пример 4. Определение содержания РНК gfp в клетках растений, в которые были введены вирусные векторы pA7248AMV-GFP и pA7248-GFP

Общее количество синтезируемого GFP зависит как от содержания мРНК в клетке, которое определяется уровнем продукции и/или стабильностью мРНК, так и от эффективности трансляции. Поэтому, чтобы выяснить, какой из этих факторов играет главную роль в обнаруженных нами различиях в продукции GFP, мы сравнивали концентрацию мРНК gfp в клетках растений, в которые были введены вирусные векторы pA7248AMV-GFP и pA7248-GFP с помощью обратной транскрипции и последующей ПЦР в реальном времени.

РНК выделяли из растений с использованием набора "QIAGEN" ("RNeasy Plant Mini Kit"). Препараты РНК обрабатывали ДНКазой фирмы "Promega". кДНК получали с помощью набора фирмы "Fermentas" (Литва, M-MuLV Reverse Transcriptase) с праймером олиго (dT)₁₈. кДНК гена gfp выявляли с помощью ПЦР в реальном времени (набор реактивов для проведения ПЦР-РВ в присутствии Sybr Green I, "Синтол") с использованием праймеров GFPPCR-1 (CGA CGT GAA CGG ССА САА GT) и GFPPCR-2 (ATG GTG CGC TCC TGG ACG ТА), определяя зависимость количества синтезируемого продукта от номера цикла ПЦР. Было установлено, что на каждом из 40 циклов ПЦР значения сигнала, отражающего содержание мРНК gfp, для двух препаратов совпадали в пределах погрешности измерения. Следовательно, содержание мРНК gfp в клетках растений, в которые были введены вирусные векторы pA7248AMV-GFP и pA7248-GFP, одинаково. Таким образом, мы установили, что присутствие лидерной последовательности AMV не влияет на содержание мРНК в растительной клетке. Следовательно, увеличение уровня продукции GFP является следствием увеличения эффективности трансляции мРНК, обусловленное наличием последовательности AMV перед целевым геном.

ЛИТЕРАТУРА

1. Goelet,P., Lomonossoff. G.P., Butler. P.J., Akam.M.E., Gait. M.J., Karn, J. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79, 5818-5822.

2. Skryabin, К. G., Morozov, S. Yu., Kraev, A. S., Rozanov, M. M., Chemov, B. K., Atabekov, J. G. (1988). FEBS Lett. 240, 33-40.

3. Skryabin K.G., Kraev A.S., Morozov S.Yu., Rozanov M.N., Chernov B.K., Lukasheva L.I., Atabekov J.G. (1988) Nucleic Acids Res., 16, 10929-10930.

4. Marillonnet S., Thoeringer C., Kandzia R., Klimyuk V., Gleba Y. (2005) Nat. Biotechnol., 23, 718-723.

5. Yusibov, V., Hooper, D., Spitsin, S., Fleysh, N., Kean, R., Mikheeva, Т., Deka, D., Karasev, A., Cox, S., Randall, J., Koprowski, H. (2002) Vaccine, 20, 3155-3164.

6. Santi L, Giritch A, Roy CJ, Marillonnet S, Klimyuk V, Gleba Y, Webb R, Arntzen CJ, Mason HS. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 861-866.

7. Wagner, В., Hufnagl, К., Radauer, С., Wagner, S., Baier, K., Scheiner, O., Wiedermann, U. Breiteneder, H. (2004) J. Immunol. Methods, 287, 203-215.

8. Giritch A, Marillonnet S, Engler C, van Eldik G, Botterman J, Klimyuk V, Gleba Y. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 14701-14706.

9. Caňizares MC, Nicholson L, Lomonossoff GP. (2005). Immunol. Cell Biol., 83, 263-270.

10. Jobling SA, Gehrke L. (1987). Nature, 325(12), 622-624.

11. Комарова Т.В., Скулачев М.В., Зверева А.С., Шварц A.M., Дорохов Ю.Л., Атабеков И.Г. (2006). Биохимия, 71, 1043-1049.

12. Reece K.S. and Phillips G.J. (1995). Gene, 165, 141-142.

Вектор на основе генома вируса Х картофеля включает функциональный в клетке растения промотор, 5'-нетранслируемый участок генома вируса Х картофеля, ген РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса Х картофеля, промотор субгеномной РНК вируса Х картофеля, последовательность 5'-нетранслируемого участка РНК 4 вируса мозаики люцерны, 3'-нетранслируемый участок генома вируса Х картофеля и функциональный в клетке растения терминатор транскрипции. Введение нуклеотидной последовательности, соответствующей 5'-нетранслируемому участку РНК 4 вируса мозаики люцерны непосредственно перед началом гена, кодирующего целевой белок, позволяет повысить уровень продукции целевого белка в 3-4 раза за счет повышения эффективности трансляции вирусной РНК. 1 ил., 1 табл.

Вирусный вектор на основе генома вируса Х картофеля, предназначенный для продукции целевого белка в растении, содержащий функционально активный в клетке растения промотор, 5'-нетранслируемый участок генома вируса Х картофеля, ген РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса Х картофеля, промотор субгеномной РНК вируса Х картофеля, последовательность 5'-нетранслируемого участка РНК 4 вируса мозаики люцерны, 3'-нетранслируемый участок генома ХВК и функционально активный в клетке растения терминатор транскрипции.