СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ Российский патент 2010 года по МПК C12N1/20 C12R1/32 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к медицинской и ветеринарной микробиологии, и может быть использовано для лабораторной диагностики туберкулеза.

Трудности выделения МБТ из патологического материала связаны с биологическими особенностями возбудителя (медленность роста), а также со снижением жизнеспособности микобактерий в результате применения антибактериальных препаратов и различных методов обработки при посеве материала.

Имеющееся большое количество питательных сред далеко не всегда отвечает необходимым требованиям, многие являются дорогостоящими, как и наиболее часто употребляемая среда Левенштейна-Йенсена.

Питательные среды (различные модификации среды Левенштейна-Йенсена), получаемые соединением водного раствора солей, яичной массы и раствора малахитового зеленого, не подлежат длительному хранению, т.к. быстро начинают терять свои ростовые свойства.

Для обеспечения оптимальной работы по выделению МБТ из патологического материала необходимо разработать такой способ получения питательной среды, чтобы среда, полученная этим способом, обладала достаточным сроком хранения и необходимыми питательно-ростовыми свойствами и не содержала дорогостоящих материалов.

Известен способ приготовления питательной среды Левенштейна-Йенсена для выделения микобактерий [приказ МЗ РФ №109 от 21 марта 2003 года «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации», Приложение 11 «Инструкция по унифицированным методам микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза», с.266-267], включающий приготовление водного раствора ингредиентов, приготовление яичной массы, приготовление водного раствора малахитового зеленого (бактерицидного вещества, угнетающего рост посторонней микрофлоры), соединение водного раствора с яичной массой и водным раствором малахитового зеленого, фильтрацию, разлив в емкости для хранения и коагуляцию при следующем соотношении ингредиентов водного раствора:

Калий однозамещенный фосфорнокислый - 2,4 г Магний сернокислой - 0,24 г Натрий лимоннокислый - 0,6 г L-аспаргин - 3,6 г Глицерин - 12,0 мл Дистиллированная вода - до 600,0 мл

Готовят водный раствор вышеперечисленных ингредиентов, растворяя их в дистиллированной воле в указанной последовательности при слабом подогревании. Стерилизуют в автоклаве 30 минут при одной атмосфере (121°С).

Раствор малахитового зеленого готовят, растворяя в 100 мл дистиллированной стерильной воды 2 г малахитового зеленого. Помещают раствор в термостат на 1-2 часа и затем стерилизуют при 1 атм 30 минут

Яичную массу приготовляют из свежих диетических куриных яиц без трещин и дефектов, моют в мыльном растворе и оставляют в нем на 30 минут, промывают в проточной воде и погружают в 70% этиловый спирт на 30 минут. Затем в стерильном боксе разбивают яйца стерильным ножом в стерильную посуду, доводя их количество до 1 литра (20-25 яиц) и тщательно взбивают стерильным венчиком.

Далее в стерильную емкость помещают водный раствор солей с глицерином в количестве 600 мл, затем гомогенизированную яичную массу в количестве 1000 мл, перемешивают, фильтруют. К фильтрату добавляют водный раствор малахитового зеленого, еще раз фильтруют, перемешивают, разливают в пробирки емкостью 4-5 мл. Для образования скоса питательной среды пробирки укладывают в наклонном положении в аппарат для свертывания типа «АСИС», предварительно нагретый до 85°С. Среду коагулируют 45 минут при температуре 85°С.

Питательная среда, приготовленная по известному способу, до коагуляции может храниться не более 2 суток, а после коагуляции (в свернутом виде) до 3-4 недель до использования, при этом уже после недели хранения ростовые свойства среды (биологическая активность) начинают снижаться.

Наиболее близким к заявляемому является способ приготовления питательной среды для выращивания микобактерий (а.с. СССР №278039), включающий соединение взятых в соотношении 40-60% - 60-40% соответственно водного раствора ингредиентов с желтковой массой куриных яиц с введенным в нее водным раствором малахитового зеленого, фильтрацию полученной питательной среды, разлив ее в рабочие емкости и коагуляцию при следующем соотношении ингредиентов в водном растворе:

Калий однозамещенный фосфорнокислый - 0,8-1,6 г Натрий лимоннокислый - 0,8-1,6 г Магний сернокислой - 0,8-1,2 г Гликокол - 3,0-6,0 г Глицерин - 72,0-96,0 мл Дистиллированная вода до 1000,0 мл.

Способ осуществляют следующим образом.

Ингредиенты растворяют в подогретой дистиллированной воде в указанном порядке по рецепту, разливают в стерильные флаконы по 100-200 мл и стерилизуют в автоклаве 3 минуты при 1,5 атмосферах.

Желтковую массу приготовляют из свежих яиц, которые предварительно моют щеткой с мылом и выдерживают 5-10 минут в 2,5% растворе йода на 48% спирте (этиловом), который приготовляют следующим образом: на 1 часть 5% спиртового раствора йода добавляют 1 часть дистиллированной воды. Приготовленный раствор йода можно многократно использовать и длительно хранить. После обработки яиц раствор сливают, яйца высушивают на воздухе, затем отделяют белок. Желтки вносят в стерильную колбу с бусами (битым стеклом) и встряхивают. На каждые 100 мл желтковой массы (объем 5-6 желтков) добавляют до 3,5 мл 2% водного раствора малахитовой зелени, простерилизованной в автоклаве 30 минут при 1,5 атмосферах.

В полученную смесь желтков с малахитовым зеленым вливают в указанном соотношении раствор ингредиентов, гомогенизируют, разливают в пробирки по 4 мл. Для образования скоса питательной среды пробирки укладывают в наклонном положении в аппарат для свертывания, предварительно нагретый до 90°С. Среду коагулируют 15-25 минут при температуре 82-83°С.

Полученная по этому способу питательная среда, обладает более высокими ростовыми свойствами в силу присутствия в ней желтковой массы, обладающей высокими питательными свойствами по сравнению с яичной массой, и отсутствия белков яиц, ингибирующих рост микобактерий за счет своих бактерицидных свойств.

Кроме того, питательная среда, приготовленная по этому способу, требует меньших затрат на ее приготовление ввиду отсутствия в ее составе дорогостоящего ингредиента L-аспаргина, а в качестве источника железа, необходимого для роста микобактерий, используется гликокол.

Сроки роста колоний лабораторного штамма МБТ H37Rv на этой питательной среде составляют 8-10 дней, в то время как на среде Левенштейна-Йенсена - 20-24 дня

Однако пробирки с питательной средой, полученной по этому способу, могут храниться в холодильнике при температуре +5°С лишь до 3-4 недель, для этого их необходимо герметично укупорить и поместить в полиэтиленовые пакеты, чтобы предотвратить высыхание среды. Но, как говорилось выше, уже после недели хранения ростовые свойства среды (биологическая активность) начинают снижаться.

В основу изобретения положена задача расширения ассортимента питательных сред для выращивания микобактерий и повышение селективных свойств среды.

Поставленная задача решается тем, что в способе приготовления питательной среды для выращивания микобактерий осуществляют приготовление глицеринового раствора путем растворения в глицерине калия однозамещенного фосфорнокислого, натрия лимоннокислого, магния сернокислого, гликокола, малахитового зеленого при следующем соотношении компонентов:

Калий однозамещенный фосфорнокислый 0,5±0,2 г Натрий лимоннокислый - 0,5±0,2 г Магний сернокислый - 0,5±0,2 г Гликокол - 2,0±1 г Малахитовый зеленый - 0,35±0,07 г Глицерин 35±10 мл

введение полученного глицеринового раствора в желтковую массу, которую берут в объеме, равном 11-20 объемов глицеринового раствора, с получением концентрата, с последующим разведением полученного концентрата в дистиллированной воде, объем которой берут не менее 1,2 объема концентрата.

Известно, что желтковая масса не обладает длительным сроком хранения. Нами было обнаружено, что при растворении калия однозамещенного фосфорнокислого, натрия лимоннокислого, магния сернокислого, гликокола и малахитового зеленого непосредственно в глицерине этот глицериновый безводный раствор обладает консервирующими свойствами, позволяющими сохранять безводную основу - концентрат для получения питательной среды, включающий желтковую массу, длительное время.

Хранение концентрата питательной среды осуществляют:

- при температуре 4±1°С в течение 3-4 - месяцев;

- при температуре -5±1°С в течение 2 лет.

Как видно из представленной таблицы, высокая концентрация ингредиентов концентрата обеспечила сохранение ростовых свойств приготовленной из него питательной среды.

Способ осуществляют следующим образом.

Желтковую массу приготовляют из свежих яиц, которые предварительно моют щеткой с мылом и выдерживают 5-10 минут в 2,5% растворе йода на 48% спирте (этиловом), который приготовляют следующим образом: на 1 часть 5% спиртового раствора йода добавляют 1 часть дистиллированной воды. Приготовленный раствор йода можно многократно использовать и длительно хранить. После обработки яиц раствор сливают, яйца высушивают на воздухе, затем отделяют белок. Желтки вносят в стерильную колбу с бусами (битым стеклом) и встряхивают.

На один литр питательной среды необходимо 27±2 желтка куриных диетических яиц первой весовой категории ГОСТ 27583-88.

Готовят безводный раствор 0,5 г калия однозамещенного фосфорнокислого, 0,5 г натрия лимоннокислого, 0,5 г магния сернокислого, 2 г гликокола и 0,35 г малахитового зеленого непосредственно в 35 мл глицерина, для чего его ингредиенты в указанной последовательности вводят в глицерин, помещенный в емкость объемом ~2 литра, и тщательно растворяют.

Полученный глицериновый раствор вводят в 500 мл желточной массы, тщательно гомогенизируют и разливают в стерильные флаконы емкостью 250 мл, герметически укупоривают и помещают полученный концентрат для последующего получения питательной среды в холодильник, выбирая температуру в зависимости от заданных сроков хранения концентрата.

Срок годности концентрата питательной среды составляет 3-4 месяца при хранении при температуре 4±1°C и 2 года при температуре -5±1°С.

Для приготовления питательной среды из концентрата берут 500 мл последнего, наливают в стерильную стеклянную колбу емкостью 2000 мл и постепенно вливают 600 мл стерильной дистиллированной воды комнатной температуры (18±1°С), тщательно перемешивают до полного растворения смеси, которое наступает не позже чем через 5 мин, после чего фильтруют и разливают в стерильные пробирки по 5 мл. Для образования скоса полученной питательной среды пробирки укладывают в наклонном положении под углом 12° и коагулируют в наклонном положении 20 мин при температуре +82°С.

После коагуляции питательной среды поверхность косяка получилась гладкой и глянцевой, структура косяка - гомогенной и плотной, но с сохранением упругости. В пробирке остается конденсационная влага 0,2+0,1 мл. При определении лекарственной чувствительности и типировании микобактерий конденсационную влагу следует удалить. Концентрат для приготовления питательной среды является специфически активным, если питательная среда, приготовленная из него, дает аналогичный рост колоний микобактерий лабораторного штамма H37Rv не меньше, чем на нативной среде.

Сравнительный анализ питательной среды по а.с. СССР №278039 и питательной среды, полученной заявляемым способом, представлены в таблице.

Как видно из таблицы, ростовые свойства среды, полученной заявляемым способом, совпадают с ростовыми свойствами среды, приготовленной на нативной воде, а количество проростов посторонней микрофлоры даже уменьшилось за счет консервирующих свойств глицеринового раствора и высокой концентрации ингредиентов в хранящемся концентрате.

Таким образом, с помощью заявляемого способа была приготовлена питательная среда, полученная из безводного ее концентрата, обладающего длительным сроком хранения, ростовые свойства которой идентичны ростовым свойствам питательной среды, получаемой традиционными способами. С помощью заявляемого способа может быть получена любая плотная среда на желтково-яичной основе, например среда Левенштейна-Йенсена.

Показатели Вид питательной среды По а.с СССР №278039 Полученная по заявляемому способу 1. Технология приготовления     Время растворения, минуты 10 5 2. Режим свертывания     2.1 Температура, +°С 82±1 82±1 2.2 Время свертывания 35 30 3. Биологические свойства питательной среды         3.1 Сроки роста лабораторных     штаммов (в сутках) 4-5 4-5 3.1.1 H37Rv 3-4 3-4 3.1.2 M.Smegmatis 5-6 5-6 3.1.3 Штамм BCG     3.2 Количество выросших колоний в % у лабораторных штаммов     98-99 99-100     3.3 Высеваемость различных штаммов МБТ из патологического материала в %     25-28 26-28     3.4 Проросты посторонней микрофлоры при исследовании патологического материала в %     0,5-0,6 0,2-0,3    

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для лабораторной диагностики туберкулеза. Способ предусматривает приготовление глицеринового раствора путем растворения в глицерине калия однозамещенного фосфорнокислого, натрия лимоннокислого, магния сернокислого, гликокола, малахитового зеленого в заданном соотношении компонентов, введение полученного глицеринового раствора в желтковую массу, которую берут в объеме, равном 11-20 объемов глицеринового раствора, с получением концентрата. Полученный концентрат разводят дистиллированной водой, объем которой берут не менее 1,2 объема концентрата. Изобретение позволяет повысить селективные свойства питательной среды и расширить ассортимент питательных сред для выращивания микроорганизмов. 1 табл.

Способ приготовления питательной среды для выращивания микобактерий, предусматривающий приготовление глицеринового раствора путем растворения в глицерине калия однозамещенного фосфорнокислого, натрия лимоннокислого, магния сернокислого, гликокола, малахитового зеленого при следующем соотношении компонентов, г:
калий однозамещенный фосфорнокислый 0,5±0,2 натрий лимоннокислый 0,5±0,2 магний сернокислый 0,5±0,2 гликокол 2,0±1,0 малахитовый зеленый 0,35±0,07 глицерин, мл 35±10

введение полученного глицеринового раствора в желтковую массу, которую берут в объеме, равном 11-20 объемам глицеринового раствора, с получением концентрата, с последующим разведением полученного концентрата в дистиллированной воде, объем которой берут не менее 1,2 объема концентрата.