ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 2021 года по МПК C12N1/20 C12R1/32 

Изобретение относится к микробиологии, в частности, к производству питательных сред, и может быть использовано в медицине и ветеринарии при диагностике туберкулеза.

Известна стандартная среда Левенштейна-Йенсена для первичного выделения возбудителя М. bovis и определения его лекарственной чувствительности, которая состоит из солевого раствора (калий фосфорнокислый - 2,4 г, магний сернокислый - 0,34 г, магний лимоннокислый - 0,6 г, аспарагин - 3,6 г, глицерин - 12 мл, вода дистиллированная - до 600 мл), яичной массы - 1000 мл (20-25 яиц), водного 2%-ный раствора малахитовой зелени - 20 мл и картофельного крахмала - 30 г («Наставление по диагностике туберкулеза». - М., 2002. - С. 47).

Недостатком питательной среды Левенштейна-Йенсена является постоянный, но незначительный рост микобактерий, который проявляется лишь при наличии в 1 см взвеси микобактерий не менее 100 микробных клеток, а также дорогостоящие ингредиенты среды (аспарагин, яичная масса).

Известна питательная среда для культивирования микобактерий туберкулеза содержащая калий фосфорнокислый - 2,0 г, магний сернокислый - 0,28 г, магний лимоннокислый - 0,5 г, L - аспарагин - 3,0 г, глицерин - 10 мл, картофельный крахмал - 30 г, дистиллированную воду до 500 мл, водный 2% раствор малахитового зеленого - 20 мл, яичную массу - 1000 мл, водный экстракт порошка из хвостов марала - 100 мл, приготовленный путем экстракции порошка водой в соотношении 1:10 соответственно при температуре 95,5-99,5°С и атмосферном давлении в течение 2-3 часов. Патент Ru 2410425, МПК C12N 1/20, C12R 1/32, опубл. 27. 01. 2011 бюл. №3) - прототип.

Недостатком данной среды является высокая стоимость ингредиентов, так цена L - аспарагина составляет 15549 рублей за 1 кг (доля его стоимости в 300 мл солевого раствора - 280 рублей). Рыночная стоимость порошка хвостов марала широко используемого в медицине составляет 20000 рублей за 1 кг, а использование яичных сред для выращивания первичных культур микобактерий туберкулеза характеризуется большим расходом яиц, являющихся одним из основных продуктов питания человека. Так стоимость 300 мл среды Левештейна-Йенсена фирмы НИЦФ составляет 460 рублей, среды по прототипу - 400 рублей, стоимость 300 мл заявленной среды - 100 рублей. Кроме этого, в связи с эволюционной изменчивостью возбудителя туберкулеза, бесконтрольным использованием лекарственных средств и биопрепаратов снижается информативность бактериологических исследований при туберкулезе, поэтому для повышения качества, предъявляемого к современной бактериологической диагностики туберкулеза, рекомендуется применять посев патологического материала на нескольких (2-3) питательных средах, что приводит к повышению трудозатрат и времени на проведение исследований.

Задачей, на решение которой направлено заявленное изобретение, является повышение информативности питательной среды для культивирования микобактерий туберкулеза при значительном снижении себестоимости производства среды.

Указанный технический результат достигается тем, что в питательной среде для культивирования микобактерий туберкулеза, содержащей солевой раствор, уплотнитель среды и водный 2%-ный раствор малахитового зеленого, согласно заявленному изобретению, солевой раствор включает гидролизат из шкуры марала, калий фосфорнокислый однозамещенный, магний сернокислый и лимонную кислоту, а в качестве уплотнителя среды используют агар-агар при следующем содержании компонентов:

гидролизат из шкур марала 600 мл калий фосфорнокислый однозамещенный 2,4 г магний сернокислый 0,34 г лимонная кислота 0,6 г агар-агар 9,6 г не менее водный 2%-ный раствор малахитового зеленого 20 мл,

при этом гидролизат из шкур марала готовят путем водной экстракции при соотношении фарш из шкуры:вода 1:10 под воздействием ультразвуковых колебаний частотой 22 кГц в течение 1-1,5 ч и температуре 60-65°С. Количество агар-агара может варьировать в зависимости от плотности получаемого гидролизата, которая в свою очередь зависит от категории сырья (шкура летняя, зимняя).

Основанием для изучения возможности использования гидролизата из шкуры марала в качестве эффективного стимулятора роста микобактерий туберкулеза бычьего вида, явились данные сравнительного биохимического состава биопродукции пантового оленеводства, представленные в таблице 1.

Согласно данным таблицы 1 показатель аминокислот, жира наиболее значителен в гидролизате из шкур маралов, где такие востребованные для роста и развития микобактерий аминокислоты как аспарагин, аланин, аргинин, пролин и серии содержатся в более высоком количестве по сравнению с их содержанием в хвостах (по прототипу). Кроме того высокий процент жиров и фосфолипидов обеспечивает энергетический потенциал жизнеобеспечения микроорганизмов, при этом фосфолипиды, необходимые для построения клетки микобактерий, в шкуре маралов составляют 43% от суммы липидов. Следует отметить, что микобактерий туберкулеза, в отличие от других микроорганизмов, характеризуются высоким содержанием липидов (10-14% сухого вещества микобактерий), при этом фосфолипиды составляют около 20% от всех липидов микобактерий.

Основным источником азота являются аминокислоты, в частности аспарагиновая, глутоминовая, аланиновая. Исключительно важным для роста микобактерий (лимитирующим фактором роста) является амид аспаргиновой кислоты - аспаргин, который в большом количестве содержится в шкуре марала. В субстанциях из шкур и хвостов маралов витаминный состав находится на уровне 89,4% и 90,7% соответственно, поэтому недостатка витаминного состава при замене сырья не выявлено. Содержание коллагена в шкуре марала может достигать 80%. Шкура маралов богата макро- и микроэлементами. Минеральные вещества не только входят в структуру клетки и активизируют ферменты, но и определяют физико-химические свойства сред. Богатый аминокислотный и минеральный состав гидролизатов из шкур маралов, позволил изменить составляющие ингредиенты солевого раствора питательной среды. Сбалансированный солевой раствор, использованный для приготовления питательной среды, обеспечивал необходимый уровень рН, осмотическое давление в клетках и соответствующую концентрацию необходимых неорганических веществ.

При разработке оптимальных параметров процесса гидролиза субстрата из шкур марала по ходу предварительных исследований установлено, что для сохранения витаминного и аминокислотного состава, оптимальный температурный режим проведения экстракции должен быть на уровне не выше 60-65°С, поэтому для оптимизации процесса позволяющей при данной температуре повысить выход сухих веществ было использовано ультразвуковое воздействие частотой 22 кГц на процесс экстрагирования субстрата при времени воздействия 0,5; 1; 1,5 ч и соотношении фарш из кожи:вода 1:5; 1:10; 1:15. Результаты исследований отражены в таблице 2.

Как показали исследования, оптимальным режимом проведения экстракции следует считать 1-1,5 часовую экстракцию при разведении фарш из шкуры:вода 1:10, при которой выход сухого вещества находился на уровне 38,2-38,4%, что на 61% выше выхода сухого вещества при экстракции хвостов по прототипу и обеспечило более богатый биохимический состав гидролизата из шкур марала пригодного для производства коллоидной основы плотной питательной среды при наличии необходимых, для ускорения культивирования микобактерий, веществ. Кроме этого степень разведения 1:10 обеспечила достаточное количество воды в составе солевого раствора.

Питательная среда с гидролизатом из шкуры марала была испытана на пробе биоматериала от зараженной морской свинки, у которой на вскрытии во внутренних органах и лимфатических узлах выявлены характерные для туберкулеза изменения. Предобработку биоматериала от морской свинки производили по методу Аликаевой с дальнейшими посевами на 60 пробирках каждой среды.

В таблице 3 приведены сравнительные испытания характера роста микобактерий на питательных средах: среда Левенштейна-Йенсена, среда по прототипу и питательной среды по заявленному изобретению.

Согласно данных таблицы 3, срок появления первичного роста микобактерий одинаков на заявленной среде и по прототипу, при этом на среде по заявленному изобретению рост микобактерий не наблюдался только в 1 пробирке (2%), в то же время в среде по прототипу в 3 пробирках (5%). Кроме этого с момента появления первичного роста (20, 6 и 6 суток) на средах начинался интенсивный рост микобактерий и достигал своего максимального уровня накопления бактериальной массы (89, 94 и 110 точечных колоний) в разные сроки (26, 13 и 10 суток). Таким образом, накопление бактериальной массы по заявленному изобретению в течение 4-х дней (110 точечных колоний) по сравнению с прототипом, где в течение 7 дней выявлено 94 точечных колоний данный показатель был выше на 17%, что в свою очередь приводит к сокращению сроков постановки диагноза и позволяет начать в более ранние сроки проведение лечебно-профилактических мероприятий.

Пример. Питательную среду для культивирования микобактерий туберкулеза готовили следующим образом. Сначала, согласно технологическим параметрам, отраженным в описании изобретения, готовили гидролизат из фарша шкуры марала с размерами частиц 3 мм. Фарш помещали в рабочую емкость экстрактора и заливали водой в соотношении фарш:вода 1:10. Экстракцию проводили при температуре 65°С в течение одного часа под воздействием ультразвука частотой 22 кГц. Содержимое емкости фильтровали через ватно-марлевый фильтр. К 600 мл гидролизата добавляли калий фосфорнокислый однозамещенный 2,4 г, магний сернокислый 0,34 г, лимонную кислоту 0,6 г и агар-агар 9,6 г. Субстрат кипятили в течение 2 мин до полного растворения агар-агара. К готовому раствору добавляли 20 мл 2% водный раствор малахитового зеленого, разливали по пробиркам 5 мл, автоклавировали в течение 30 мин, при 0,5 атм, после автоклавирования пробирки укладывали в наклонном положении до полного затвердевания среды. Среда готова к использованию.

Таким образом, богатый биохимический состав гидролизата из шкур маралов при его использовании в составе солевого раствора среды, позволяет исключить из ее состава дорогостоящие компоненты (яйцо, аспарагин) и обеспечить высокие информативные показатели среды, позволяющие ускорить диагностику туберкулеза животных и обеспечить более раннее проведение мероприятий по ликвидации инфекции, а поскольку шкуры марала не нашли широкого применения в других отраслях и большей частью утилизируется, то их использование для производства питательных сред обеспечивает значительное снижение себестоимости продукта.

Изобретение относится к области биотехнологии. Сущность изобретения заключается в том, что в состав солевого раствора при производстве среды включен гидролизат из шкур марала, обладающий высокими биохимическими показателями, необходимыми для производства питательной среды, а плотность среды достигается добавлением агар-агара. Использование заявленного изобретения позволяет ускорить диагностику туберкулеза и своевременно провести мероприятия по ликвидации инфекции. 3 табл., 1 пр.

Питательная среда для культивирования микобактерий туберкулеза содержащая солевой раствор, уплотнитель среды и водный 2%-ный раствор малахитового зеленого, отличающаяся тем, что солевой раствор включает гидролизат из шкур марала, калий фосфорнокислый однозамещенный, магний сернокислый и лимонную кислоту, а в качестве уплотнителя среды используют агар-агар при следующем содержании компонентов:

гидролизат из шкур марала 600 мл калий фосфорнокислый однозамещенный 2,4 г магний сернокислый 0,34 г лимонная кислота 0,6 г агар-агар 9,6 г не менее водный 2%-ный раствор малахитового зеленого 20 мл,

при этом гидролизат из шкур марала готовят путем водной экстракции при соотношении фарш из шкуры:вода 1:10 под воздействием ультразвуковых колебаний частотой 22 кГц в течение 1-1,5 ч и температуре 60-65°С.