ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ Российский патент 2007 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической микробиологии, и может быть использовано для ранней диагностики туберкулеза.

В последнее время наблюдается рост показателей заболеваемости туберкулезом. В этой связи значительное внимание уделяется лабораторной диагностике туберкулеза.

В настоящее время для выделения (культивирования) микобактерий и определения их чувствительности к лекарственным препаратам используется ряд плотных яичных питательных сред Левенштейна-Иенсена, Финн II [Приказ МЗ РФ от 21.03. 2003 №109 "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации" М., стр.266-270], среда Мордовского [Методические указания МЗ РСФСР "Приготовление и использование новой питательной среды для выращивания микобактерий туберкулеза", М. - 1972].

Недостатком плотных питательных сред являются длительные сроки роста микобактерий при посеве диагностического материала - 2,5-10 недель, а при пересевах культур и определении лекарственной чувствительности - 12-21 день, что затрудняет раннюю бактериологическую диагностику и своевременную коррекцию лечения.

Применение жидких питательных сред позволяет ускорить выявление микобактерий, что важно для раннего начала лечения больных туберкулезом. Известно использование для этих целей жидких сред, содержащих комплекс солей и L-аспарагин в качестве источника азотистого питания: Соттона (Sauton) [B.H.Василев. Микобактериозы и микозы легких. София, 1971 г., стр.156], Школьниковой [Приказ МЗ РФ от 21.03. 2003 №109 "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации". М., стр.270-271]. Недостатком этих сред является высокая степень проростов посторонней микрофлоры и использование дорогостоящих ингредиентов.

Наиболее близким решением технической задачи данного назначения к заявляемому изобретению является среда для выделения микобактерий туберкулеза Lebek [B.H.Василев. Микобактериозы и микозы легких. София, 1971 г., стр.163], содержащая аспарагин, натрий лимоннокислый, магний сернокислый, железо лимоннокислое аммиачное, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный, глицерин, дистиллированную воду, краситель бромтимоловый синий, агар-агар и говяжью сыворотку крови. Однако эта среда используется в основном для дифференцировки атипичных микобактерий. Входящий в состав питательной среды бромтимоловый синий оказывает тормозящее действие на рост микобактерий туберкулеза, а под влиянием аспарагина возникает конгломеративный рост колоний микобактерий, что осложняет учет результатов исследований.

В основу изобретения поставлена задача повышения ростовых свойств питательной среды.

Поставленная задача решается тем, что в среду, содержащую калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный, магний сернокислый, натрий лимоннокислый, железо лимоннокислое аммиачное, фактор роста, агар-агар, глицерин, сыворотку животного, бактерицидный краситель и воду, дополнительно вводят в качестве ростового фактора натрий пировинограднокислый, в качестве аминокислоты используют α-аминоуксусную кислоту, в качестве бактерицидного красителя - малахитовый зеленый, а основным питательным веществом является инактивированная лошадиная сыворотка. Введение α-аминоуксусной кислоты и натрия пировинограднокислого способствует ускорению роста микобактерий с гомогенным их распределением в питательной среде. Инактивация лошадиной сыворотки при 56°С в течение 40 минут снижает ее ингибирующее действие на микобактерии. Бактерицидный краситель малахитовый зеленый обладает оптимальным действием на сопутствующую микрофлору, не вызывая задержки роста микобактерии.

Состав питательной среды при следующих соотношениях, г/л:

калий фосфорнокислый однозамещенный2,0-3,0натрий фосфорнокислый двузамещенный1,0-2,0магний сернокислый0,25-0,75натрий лимоннокислый1,0-2,0железо лимоннокислое аммиачное0,03-0,07агар-агар2,0-4,0сыворотка лошадиная инактивированная150,0-250,0малахитовый зеленый0,04-0,06глицерин20,0-40,0α-аминоуксусная кислота0,5-1,5натрий пировинограднокислый0,1-0,2вода дистиллированнаядо 1 л

Среду получают следующим образом.

Пример 1.

1. В 20 мл горячего глицерина растворяют 0,04 г малахитового зеленого.

2. 150 мл лошадиной сыворотки инактивируют при 56°С 40 мин и соединяют с раствором малахитового зеленого.

3. Готовят солевой раствор, для чего в 200 мл дистиллированной воды последовательно растворяют 2,0 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 1,0 г натрия фосфорнокислого двузамещенного, 0,25 г магния сернокислого, 1,0 г натрия лимоннокислого, 0,03 г железа лимоннокислого аммиачного, 0,5 г α-аминоуксусной кислоты, 0,1 г натрия пировинограднокислого.

Полученный раствор стерилизуют в автоклаве при 1,5 атм 1 мин и после охлаждения соединяют со смесью 2.

4,2 г агар-агара растворяют в оставшемся количестве дистиллированной воды, стерилизуют при 1 атм 30 мин, соединяют со смесью 3, тщательно перемешивают.

Контроль качества среды осуществляют при посеве тест-штаммов Mycobacterium tuberculosis H₃₇Rv, B-5 и свежевыделенных культур от больных туберкулезом легких. Учет результатов проводят визуально по помутнению среды через 2-8 суток инкубации посевов при температуре 37°С.После 2-8 суток инкубации содержимое пробирок центрифугируют при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, из осадка делают мазки для просмотра в люминесцентном микроскопе.

Пример 2. Отличается от примера 1 тем, что для приготовления смеси 1 используют 30 мл глицерина и 0,05 г малахитового зеленого, для приготовления смеси 2 - 200 мл лошадиной сыворотки, для солевого раствора - 2,5 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 1,5 г натрия фосфорнокислого двузамещенного, 0,5 г магния сернокислого, 1,5 г натрия лимоннокислого, 0,05 г железа лимоннокислого аммиачного, 1,0 г α-аминоуксусной кислоты, 0,15 г натрия пировинограднокислого, для приготовления раствора 4 - 3 г агар-агара. Далее среду готовят согласно примеру 1.

Пример 3. Отличается от примера 1,2 тем, что для приготовления смеси 1 используют 40 мл глицерина и 0,06 г малахитового зеленого, для приготовления смеси 2 - 250 мл лошадиной сыворотки, для солевого раствора - 3,0 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 2,0 г натрия фосфорнокислого двузамещенного, 0,75 г магния сернокислого, 2,0 г натрия лимоннокислого, 0,07 г железа лимоннокислого аммиачного, 1,5 г α-аминоуксусной кислоты, 0,2 г натрия пировинограднокислого, для приготовления раствора 4 - 4 г агар-агара. Далее среду готовят согласно примерам 1, 2.

После 2-8 суток инкубации содержимое пробирок центрифугируют при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, из осадка делают мазки для просмотра в люминесцентном микроскопе.

Результаты бактериологического контроля предлагаемой и известной сред представлены в таблице.

Из таблицы видно, что сроки роста микобактерий туберкулеза на предлагаемой питательной среде сократились по сравнению с прототипом у лабораторного штамма H₃₇Rv в 1,3-1,6 раза, у штаммов, выделенных от больных, в 1,3-1,7 раза и составили в среднем 6 суток. Выявляемость микобактерий туберкулеза из мокроты больных увеличилась при отрицательных результатах бактериоскопии с 27 до 33%, при положительной бактериоскопии с 66 до 78%, при сокращении сроков роста по сравнению с прототипом на 205 суток.

Таким образом, предлагаемая среда обеспечивает рост микобактерий туберкулеза, что способствует их выявляемости в максимально короткие сроки.

Таблица
Характеристика ростовых свойств питательной среды на основании проведенных исследований (1500 пробирочных опытов)Исследуемый материалРост микроорганизмов на питательных средахПрототипПредлагаемая среда по составу  МинимальныйСреднийМаксимальныйСроки роста (сутки)Количество колоний, %Сроки роста (сутки)Количество колоний, %Сроки роста (сутки)Количество колоний, %Сроки роста (сутки)Количество колоний, %Лабораторный штамм H₃₇Rv89869861005100Штаммы, выделенные от больных10958987986100Мокрота больных при положительной бактериоскопии1666147314781478Мокрота больных при отрицательной бактериоскопии2127162916321633Проросты при иследовании мокроты632748282

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической микробиологии, и может быть использовано для ранней диагностики туберкулеза. Питательная среда для выделения микобактерий содержит калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный, магний сернокислый, натрий лимоннокислый, железо лимоннокислое аммиачное, аминокислоту, агар-агар, глицерин, сыворотку лошадиную инактивированную, краситель малахитовый зеленый и воду дистиллированную. Введение α-аминоуксусной кислоты и натрия пировинограднокислого способствует ускорению роста микобактерий с гомогенным их распределением в питательной среде. Инактивация лошадиной сыворотки при 56°С в течение 40 минут снижает ее ингибирующее действие на микобактерии. Бактерицидный краситель - малахитовый зеленый обладает оптимальным действием на сопутствующую микрофлору, не вызывая задержки роста микобактерий. Изобретение обеспечивает повышение ростовых свойств питательной среды, ускоряет рост микобактерий, что способствует их выявляемости в максимально короткие сроки. 1 табл.

Питательная среда для выделения микобактерий, содержащая калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный, магний сернокислый, натрий лимоннокислый, железо лимоннокислое аммиачное, аминокислоту, агар-агар, глицерин, сыворотку животного, бактерицидный краситель и воду дистиллированную, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит натрий пировинограднокислый, в качестве аминокислоты - α-аминоуксусную кислоту, в качестве бактерицидного красителя - малахитовый зеленый, в качестве сыворотки - сыворотку лошадиную инактивированную при следующем соотношении компонентов, г/л:

Калий фосфорнокислый однозамещенный2,0-3,0Натрий фосфорнокислый двузамещенный1,0-2,0Магний сернокислый0,25-0,75Натрий лимоннокислый1,0-2,0Железо лимоннокислое аммиачное0,03-0,07α-аминоуксусная кислота0,5-1,5Натрий пировинограднокислый0,1-0,2Агар-агар2,0-4,0Сыворотка лошадиная инактивированная150,0-250,0Малахитовый зеленый0,04-0,06Глицерин20,0-40,0Вода дистиллированнаяДо 1 л