3-Нитро-4-гидрокси-7-пропаргилтио-[1,2,4]триазоло[5,1c][1,2,4]триазин и 3-нитро-4-гидрокси-7-этилтио-[1,2,4]триазоло[5,1c][1,2,4]триазин, обладающие противовирусной активностью Российский патент 2022 года по МПК C07D487/04 A61K31/53 A61P31/12 

1. Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биологически активных соединений и касается 3-нитро-4-гидрокси-7-пропаргилтио-1,2,4]триазоло[5,1с][1,2,4]триазина и 3-нитро-4-гидрокси-7-этилтио-1,2,4]триазоло[5,1с][1,2,4]триазина, обладающих противовирусным действием, предназначенного для лечения и профилактики инфекционных заболеваний человека и животных вирусной природы. Изобретение может быть использовано в лечебных учреждениях, научно-исследовательских лабораториях, а также в животноводстве и птицеводстве.

2. Уровень техники

Актуальность проблемы создания средств для противовирусной терапии, в особенности в условиях быстрой мутации вирусов, выявления новых возбудителей опасных и медленных вирусных инфекций, вызывает постоянную потребность в новых химиопрепаратах, которые бы обладали высокой активностью, продолжительным действием и низкой токсичностью.

Вирусы Коксаки группы В принадлежат к семейству Enteroviridae - безоболочечных вирусов с (+)-РНК-геномом. Вирусы этой группы вызывают широкий спектр патологий, включая перикардиты и миокардиты, полиомиелит, неспецифическую фебрильную лихорадку, серозный менингит и менингоэнцефалит и др. В частности, вирус Коксаки В3 является одним из ведущих инфекционных агентов, обусловливающих развитие вирусного миокардита - процесса, приводящего к воспалительным реакциям в ткани миокарда и дегенерации кардиомиоцитов, ведущих, в свою очередь, к сердечной недостаточности и в 2-10% случаев - к летальному исходу {Am J Pathol. 1980; 101 (2):425-84). Коксакивирусный миокардит представляет исключительные трудности для диагностики и лечения. Это обусловлено как чисто клиническими особенностями (разная степень выраженности органических и функциональных повреждений миокарда, трудности при получении материала для биопсии, отсутствие четких маркеров заболевания), так и отсутствием эффективных этиотропных препаратов для их лечения (Pamela J. Lincez, Myocarditis, Daniela Cihakova (Ed.), InTech, 2011. DOI: 10.5772/20932). Несмотря на успехи в разработке фармакологических препаратов с противовирусной активностью, лекарственное средство, которое можно было бы широко применять в качестве эффективной этиотропной терапии против вирусов Коксаки, не разработано. Основополагающими составляющими медикаментозной терапии являются препараты симптоматической и патогенетической направленности.

С учетом всего перечисленного, разработка новых эффективных противовирусных препаратов, в том числе активных против вируса Коксаки ВЗ, является одной из первостепенных задач медицинской химии и вирусологии.

Известно противовирусное действие 3-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-4-ов. [В.Л. Русинов, Е.Н. Уломский, ОН. Чупахин, М.М. Зубаиров, А.Б. Капустин, Н.И. Митин и др. / Химико-фармацевтический журнал. №9, 1990, с. 41-44; Русинов В.Л., Чарушин В.Н., Чупахин О.Н., Известия АН, серия химическая, 2018, № 4, с. 573-599] Натриевая соль 6-метилтио-3-нитро-1,2,4-триазоло-[5,1-с]-1,2,4-триазин-4-она, дигидрат (1, препарат Триазавиин) обладает противовирусным действием в отношении вирусов гриппа, парагриппа, респираторно-синцитиальной инфекции, ВЭЛ, Синдбис, ЗЭЛ и Лиходки долины Рифт.[Чупахин О.Н., Русинов В.Л., Уломский Е.Н., Чарушин В.Н., Петров А.Ю., Киселев О.И. Патент РФ № 2294936 от 10 марта 2007 г. Бюл. изобр. 2007, № 7]. Аргениниевая соль 6-метилтио-3-нитро-1,2,4-триазоло-[5,1-с]-1,2,4-триазин-4-она 2 обладает противовирусным действием в отношении вируса лихорадки Западного Нила [Chupakhin O.N., Rusinov V.L., Ulomsky E.N., Savateev K.V., Fedotov V.V., Borisov S.S., Novirova N.A., Loginova N.A. Borisevich S.V., Sorokin P.V. United States Patent 9,790,227 B2 от 17.10.2017].

Наиболее близким по структуре и активности к заявляемым соединениям является натриевая соль 6-этилтио-3-нитро-1,2,4-триазоло-[5,1-с]-1,2,4-триазин-4-она 3, эффективная в отношении РНК-содержащих вирусав гриппа A (H5N1), лихорадки Западного Нила и выбранная в качестве прототипа [Чупахин О.Н., Русинов В.Л., Уломский Е.Н., Чарушин В.Н. Медведева Н.Р., Киселев О.И., Деева Э.Г., Логинова С.Я., Боричесвич С.В., Бондарев В.П. Патент РФ 2404182 от 20.11.2010, Бюл. Изобр. 2010, № 32].

Нужно отметить, что на сегодняшний момент, несмотря на значительное число многообещающих разработок противовирусных препаратов прямого действия, в том числе уже одобренных ВОЗ к широкому медицинскому использованию, однозначно признанных и повсеместно сертифицированных противовирусных средств для лечения инфекций, вызванных энтеровирусами, не существует [О.С. Никонов, Е.С. Черных, М.Б. Гарбер, Е.Ю. Никонова. Энтеровирусы: Классификация, вызываемые заболевания и направления разработки противовирусных средств. Успехи биологической химии, 2017, т. 57, с. 119-152].

3. Сущность изобретения

Техническим результатом данного изобретения является создание новых химических соединений азолоазиниевого ряда - 3-нитро-4-гидрокси-1,4-дигидро-7-пропаргилтио-1,2,4-триазоло[5,1с]-1,2,4-триазина 4 и 3-нитро-4-гидрокси-1,4-дигидро-7-этилтио-1,2,4-триазоло[5,1с]-1,2,4-триазина 5, обладающих противовирусным действием в отношении энтеровирусов, в частности вируса Коксаки ВЗ, размножающегося в клетках миокарда и вызывающего миокардиты у человека. На сегодняшний день химиопрепаратов и вакцин от вируса Коксаки, впрочем, как и от других энтеровирусов, нет. Данные соединения могут быть использованы для создания отечественных лекарственных противовирусных препаратов.

В литературе указанные соединения 4 и 5 способы их получения и физико-химические характеристики не описаны.

4. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Заявляемые соединения - 3-нитро-4-гидрокси-1,4-дигидро-7-пропаргилтио-1,2,4-триазоло[5,1с]-1,2,4-триазина 4 и 3-нитро-4-гидрокси-1,4-дигидро-7-этилтио-1,2,4-триазоло[5,1с]-1,2,4-триазина 5, получены по следующей схеме: Соли 3-пропаргилтио-1,2,4-триазолил-5-диазония 6 или 3-этилтио-1,2,4-триазолил-5-диазония 7, полученные из соответствующего 5-амино-3-алкилтио-1,2,4-триазолов 8, 9 действием нитрита натрия или калия в присутствии 12М соляной кислоты, конденсируют с 1-морфолин-2-нитроэтиленом в ацетонитриле.

Химическая схема синтеза заявляемых соединений

Заявляемые соединения представляют собой желтые порошки, растворимые в воде, ацетоне, диметилформамиде, диметилсульфоксиде, нерастворимые в бензоле, хлороформе и большинстве апротонных растворителей, вступающие в химические реакции с этанолом, метанолом и прочими спиртами.

Пример 1. Методика синтеза 3-нитро-4-гидрокси-1,4-дигидро-7-пропаргилтио-1,2,4]триазоло[5,1с][1,2,4]триазина (4)

К смеси 1.55 г (0.01) моль 5-пропаргилсульфанил-3-амино-1,2,4-триазола, 5 мл воды, 5 мл ацетонитрила и 10 мл конц. HCl (0.12 моль) порциями прибавляют раствор 0.936 г (0.011 моль) KNO₂ в 3 мл воды при -7÷-10 С. Реакционную массу выдерживают при этой температуре 10 мин и прибавляют к ней раствор 1.58 г (0.01) 1-морфолин-2-нитроэтилена в 60 мл ацетонитрила. Смесь выдерживают при температуре 0°С 1 час, после при комнатной температуре 12 часов. Выпавший осадок отфильтровывают и промывают охлажденной смесью ацетонитрил:вода = 1:1. Влажный осадок перекристаллизовывают из воды, фильтруют и сушат на воздухе. Выход 3 г (59%), порошок светло желтого цвета, имеет следующие физико-химические характеристики: Т_ПЛ=210-212°С; ¹Н ЯМР спектр в ДМСО-(d6 _δ, м.д.): 13,34 (с, Н, NH), 8,08 (с, Н, ОН), 6,90 (с, Н, СН), 4,14 (д., 2Н, J=2.6 Гц, СН₂), 1,47 (т., 1Н, J=2.6 Гц, СН); ¹³С ЯМР спектр в ДМСО-(d6 _δ, м.д.): 159.29,146.88, 142.62, 80.19, 73.90, 72.57, 19.38. Найдено: С - 32.88; Н - 2.44; N - 32.82. Брутто-формула - C₇H₆N₆O₃S. Вычислено: С - 33.07; Н - 2.38; N - 33.06

Пример 2. Методика синтеза 3-нитро-4-гидрокси-1,4-дигидро-7-этилтио-1,2,4]триазоло[5,1с][1,2,4]триазина (5)

К смеси 1.44 г (0.01) моль 5-этилсульфанил-3-амино-1,2,4-триазола, 5 мл воды, 5 мл ацетонитрила и 10 мл конц. HCl (0.12 моль) порциями прибавляют раствор 0.936 г (0.011 моль) KNO₂ в 3 мл воды при -7÷-10 С. Реакционную массу выдерживают при этой температуре 10 мин и прибавляют к ней раствор 1.58 г (0.01) 1-морфолин-2-нитроэтилена в 60 мл ацетонитрила. Смесь выдерживают при температуре 0°С 1 час, после при комнатной температуре 12 часов. Выпавший осадок отфильтровывают и промывают охлажденной смесью ацетонитрил:вода = 1:1. Влажный осадок перекристаллизовывают из воды, фильтруют и сушат на воздухе. Выход г 1.1 г (45%), порошок ярко-желтого цвета, имеет следующие физико-химические характеристики: Т_ПЛ=156-160°С; ¹Н ЯМР спектр в ДМСО-(d6 δ, м.д.): 13,40 (с, Н, NH), 8,13 (с, Н, ОН), 6,91 (с, Н, СН), 3,10 (кв., 2Н, J=7.3 Гц, СН₂), 1,33 (т., 1Н, J=7.3 Гц, СН); ¹³С ЯМР спектр в ДМСО-(d6 _δ, м.д.): 160.90, 147.23, 142.92, 72.80, 25.66, 15.50. Найдено: С - 29.40; Н - 3.59; N - 34.81. Бругто-формула - C₆H₈N₆O₃S. Вычислено: С - 29.51; Н - 3.30; N - 34.41

Пример 3. Оценка цитотоксичности соединений

Токсичность соединений была изучена в отношении клеток Vero. Клетки сеяли в 96-луночные планшеты и культивировали при 37°С в среде MEM с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота в атмосфере 5% CO₂ (в газопроточном инкубаторе Sanyo-175) до состояния монослоя. Из исследуемых соединений готовили маточный раствор концентрации 10 мг/мл в диметилсульфоксиде, после чего готовили серию двукратных разведений препаратов в среде MEM от 1000 до 3,75 μg/ml. Растворенный препарат вносили в лунки планшетов и инкубировали 3 суток при 37°С. По истечении этого срока клетки промывали 2 раза по 5 минут фосфатно-солевым буфером, и количество живых клеток оценивали при помощи микротетразолиевого теста (МТТ). С этой целью в лунки планшетов добавляли по 100 мкл раствора (5 мг/мл) 3-(4,5-диметилтиазолил-2) 2,5-дифенилтетразолия бромида (ICN Biochemicals Inc., Aurora, Ohio) на физиологическом растворе. Клетки инкубировали при 37°С в атмосфере 5% CO₂ в течение 2 часов и промывали 5 минут фосфатно-солевым буфером. Осадок растворяли в 100 мкл на лунку ДМСО, после чего оптическую плотность в лунках планшетов измеряли на планшетном ридере Thermo Multiskan FC при длине волны 535 нм. По результатам теста для каждого продукта определяли 50% цитотоксическую дозу (СС₅₀), т.е. концентрацию препарата, вызывающую гибель 50% клеток в культуре.

Значения СС₅₀ для 4 и 5 составили 153,7 и 138,1 мкг/мл соответственно. Полученные данные свидетельствуют о низкой цитотоксичности полученных соединений для культуры клеток.

Пример 4. Оценка острой токсичности для лабораторных животных

Острую токсичность соединений 4 и 5 оценивали при внутрибрюшинном введении мышам. Для этого навески соединений растирали в ступке в 0,5% карбоксиметилцеллюлозе и вводили внутрибрюшинно белым беспородным мышам в объеме 0,4 мл. Животным из группы плацебо внутрибрюшинно вводили 0,5% раствор карбоксиметилцеллюлозы в том же объеме. Наблюдение за животными проводили в течение трех дней, ежедневно учитывая смертность в каждой из групп животных. По истечении этого срока рассчитывали процент смертности в каждой из групп и вычисляли значение 50% летальной дозы (LD₅₀) для каждого соединения по методу Рида и Менча (The American Journal of Hygiene. 27: 493-497). Полученные данные суммированы в таблице 1.

Как видно из приведенных результатов, неспецифической смертности группе плацебо не наблюдалось. Все животные, получившие любое из соединений в дозе 500 мг/кг, погибли, тогда как ни в одной из остальных групп, получивших меньшие дозы веществ, смертности не отмечалось. На основании полученных данных значение LD50 для обоих соединений составляет 294 мг/кг, что позволяет отнести соединения к умеренно токсичным (3 класс, 40-1250 мг/кг, «Правила организации и проведения доклинических исследований лекарственных средств - GLP», ФГБУ НЦЭСМП Минздрава России).

Пример 5. Оценка противовирусного действия

Противовирусную активность соединений изучали в культуре клеток Vero в отношении вируса Коксаки ВЗ. Клетки Vero рассевали на 24-луночные планшеты, как описано в Примере 1. После формирования монослоя в лунки добавляли изучаемые соединения в соответствующих концентрациях, инкубировали 1 час и заражали клетки вирусом Коксаки ВЗ при множественности заражения 0,01 TCID₅₀ на клетку. Планшеты инкубировали 1 час, несвязавшийся вирус отмывали физиологическим раствором, добавляли свежие растворы соединений в тех же концентрациях и инкубировали планшеты при 37°С в атмосфере 5% СО₂ в течение 24 часов. После этого инфекционную активность вирусного потомства определяли при помощи титрования на клетках Vero. Для этого из культуральной жидкости готовили серию десятикратных разведений, заражали ими клетки Vero, посеянные в 96-луночные планшеты и инкубировали 72 часа при 37°С в атмосфере 5% СО₂. По прошествии этого срока визуально отмечали наличие вирусспецифического цитопатогенного действия (ЦПД) в лунках планшетов. За титр вируса принимали максимальное разведение вируса, приводящее к появлению ЦПД в половине инфицированных лунок. Титр выражали в 50% цитотоксических дозах (TCID₅₀/0,2 мл). На основании полученных данных для каждого соединения рассчитывали значение 50% ингибирующей концентрации (IC₅₀) - концентрации, снижающей титр вируса вдвое по сравнению с контролем, а также индекс селективности - отношение СС₅₀ к IC₅₀, показывающий, насколько избирательно соединение подавляет репродукцию вируса по сравнению с клеточным метаболизмом.

Полученные в результате экспериментов значения IC₅₀ для соединений 4 и 5 составили соответственно 0,5 и 1,2 мкг/мл. Таким образом, величины индексов селективности оказались соответственно 307 и 115. Эти показатели намного превосходят пороговое значение SI=10, на основании которого делается заключение о перспективности того или иного соединения как потенциального противовирусного средства (Smee D., J Virol Methods; 2017:51-56), что убедительно доказывает высокие вирусингибирующие характеристики изученных соединений.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к 3-нитро-4-гидрокси-1,4-дигидро-7-пропаргилтио-[1,2,4]триазоло[5,1с]-[1,2,4]триазину и 3-нитро-4-гидрокси-1,4-дигидро-7-этилтио-[1,2,4]триазоло[5,1с][1,2,4]-триазину, формул 4-5. Технический результат: получены новые гетероциклические соединения, обладающие противовирусной активностью в отношении энтеровирусов. 1 табл., 5 пр.

3-Нитро-4-гидрокси-1,4-дигидро-7-пропаргилтио-[1,2,4]триазоло[5,1с][1,2,4]триазин и 3-нитро-4-гидрокси-1,4-дигидро-7-этилтио-[1,2,4]триазоло[5,1с][1,2,4]триазин 4, 5, обладающие противовирусной активностью